油菜保卫细胞功能性SnRK2基因鉴定及BnSnRK2.6-2C氧化还原位点鉴定

摘要

在维管束植物中，叶片上的气孔器结构位于上下表皮，由两个保卫细胞和气孔组成。气孔开度的变化控制着植物与外界的气体交换，二氧化碳摄入，水分吸入与排出以及微生物侵染的防御。气孔运动在植物响应干旱胁迫，病原菌入侵以及如脱落酸、茉莉酸等植物激素过程中起到关键的作用。植物通过在形态学、生理和分子水平上的发育和进化来适应干旱、高盐、毒害和高温低温等不良的环境条件。其中，由蛋白激酶和蛋白磷酸酶控制的蛋白质磷酸化和去磷酸化分别在各种胁迫诱导的植物分子信号通路中起到至关重要的作用。SNF1相关激酶(SnRK)在植物中有3个家族，分别是SnRK1类、SnRK2类和SnRK3类，其中SnRK2类激酶在植物中最为人熟知，在脱落酸信号途径和植物对渗透胁迫的响应中起主要作用，同时也参与到其它形态发生和生理生化过程中，尤其在脱落酸诱导的气孔关闭过程中，SnRK2的成员起着核心的作用。在SnRK2参与的气孔相关信号通路中，氧化还原剂和环境中氧化还原变化影响其活性，进而能够调节气孔运动。油菜是重要的油料蔬菜作物，在农业和食品生产工业中有重要的地位，同时因其具有异源四倍体的基因组并与模式植物拟南芥亲源关系较近，在多倍体植物的环境适应性研究中具有很高的优势特性。另一方面，油菜的保卫细胞原生质体分离技术相对成熟，是研究植物通过气孔器适应环境的理想实验材料。本研究旨在分析氧化还原变化对油菜保卫细胞功能性SnRK2蛋白的调控机制，主要得出以下一些结论:
　　第一，通过生物信息学方法在油菜（Brassica napus）因组中共鉴定出30个SnRK2蛋白激酶基因，这些基因与油菜的二倍体亲本物种芜菁（B.rapa）和甘蓝(B.oleracea)中SnRK2基因数目和类型保持一致，并在序列和基因结构上有高度相似性。其中9个SnRK2基因的全长编码序列在油菜保卫细胞原生质体中被克隆并进行了测序鉴定。
　　第二，使用实时荧光定量PCR技术对包含测序鉴定到的9个SnRK2基因在内的14个SnRK2基因进行了表达特性分析。其中12个基因的表达特性在油菜不同生长时期的组织器官中可被检测到，并且这12个基因全部可在对叶片的干旱胁迫处理和对保卫细胞原生质体的脱落酸处理做出响应，BnSnRK2.6-2C基因在保卫细胞和脱落酸处理中表现出了较强的应答反应。
　　第三，原核表达的BnSnRK2.6-2C表现出了体外自磷酸化激酶活性，这种激酶活性受到氧化还原处理的调控。BnSnRK2.6-2C的激酶活性受到GSNO和GSSG的剂量依赖性抑制，使用不同还原剂处理后激酶活性可回复。GSNO处理同样以剂量依赖的方式使BnSnRK2.6-2C的氧化修饰水平上升，并同样可被还原剂还原。
　　第四，通过mBBr反向标记策略对BnSnRK2.6-2C的氧化还原修饰位点进行质谱鉴定，发现GSNO和GSSG确实可以引起BnSnRK2.6-2C半胱氨酸残基上的可逆性氧化修饰。C159在BnSnRK2.6-2C的6个半胱氨酸残基中表现出了最高的氧化还原敏感性。此外，鉴定结果中还包括不可逆的磺酸化巯基修饰，以及之前被认为不易被质谱鉴定到的谷胱甘酰化巯基修饰，这种谷胱甘酰化修饰可被GSSG、GSNO或者还原型谷胱甘肽诱发，且可能不完全被还原剂还原。从质谱鉴定结果可以推断GSNO和GSSG对BnSnRK2.6-2C激酶活性的抑制更可能来源于反应环境中的氧化还原变化所至。
　　第五，在本文中使用质谱检测的方法鉴定出了被mBBr标记的酪氨酸残基，填补了多年相关的研究空白。
　　本研究完善了油菜基因组中SnRK2基因和蛋白及其在气孔保卫细胞中响应胁迫变化的更全面信息，为进一步研究多倍体蔬菜作物对环境适应的分子机理提供了实验基础。同时为未来氧化还原变化通过SnRK2蛋白激酶调控气孔运动的相关研究提供了理论支持。

目录

摘要

1 绪论

1．1 油菜在生物学研究中的应用

1．2 气孔和保卫细胞

1．2．1 气孔及保卫细胞的结构和生物学功能

1．2．2 檀物激素对保卫细胞的调控

1．2．3 气孔运动中分子开关的调控机制

1．3 SnRK2蛋白激冀啸渔闭雌展

1．3．1 SnRK蛋白激奠及SnRK2蛋白激酶的结构与分类

1．3．2 SnRK2蛋白激酶在植物生长发育和逆境胁迫中的作用

1．4 细胞中的蛋白质半胱氨酸氧化还原修饰

1．4．1 细胞中蛋白质的普遍巯基氧化修饰

1．4．2 基于生物氧化还原分子的蛋白质巯基氧化修饰

1．4．3 蛋白质巯基氧化修饰的分析技术

1．5 本研究的目的和意义

2 油菜SnRK2基因的全基因组鉴定及表达特性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料的培养收集和干旱处理

2．1．2 油菜保卫细胞和叶肉细胞原生质体的分离和收集

2．1．3 保卫细胞原生质体的ABA处理

2．1．4 油菜基因组中SnRK2基因的鉴定和系统避I化分析

2．1．5 油菜SnRK2基因的染色体结构组成和顾式作用元件分析

2．1．6 油菜总RNA的提取和cDNA第—链的合成

2．1．7 油菜保卫细胞中表达的SnRK2基因鉴定及克隆

2．1．8 油菜snRK2基因的实时荧光定量PCR分析

2．1．9 油菜SnRK2基因表达模式的生物信息学分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 油菜SnRK2基因的鉴定和系统进化分析

2．2．2 油菜SnRK2基因的基因结构和颅式作用原件分析

2．2．3 油菜保卫细胞SnRK2基因在不同组织器官中的表达模式

2．2．4 油菜SnRK2基因响应干旱胁迫处理的表达分析

2．2．5 油菜保卫细胞中SnRK2基因响应ABA处理的表达分析

2．2．6 油菜砌屁配同系基因的表达偏差分析

2．3 本章小结

3 BnSnRK2.6-2C蛋白激酶的氧化还原位点鉴定

3．1．3 重组 BnSnRK2.6-2C的诱导表达和纯化

3．1．4 氧化还原处理和BnsnRK2.6-2C的体外激奠反应

3．1．5 BnSnRK2.6-2C半胱氨酸氧化修饰水平检测

3．1．6 半胱氨酸修饰和磷酸化修饰的高效液相色谱串联质谱联用检测

3．2 结果与讨论

3．2．1 BnSnRK2.6-2C的结构预测

3．2．2 BnsnRK2.6-2C体外自磷酸化活性的氧化还原调控

3．2．3 氧化还原处理后BnsnRK2.6-2C半胱氨酸残基氧化水平的变化

3．2．4 BnSnRK2.6-2C氧化还原调控位点的鉴定

3．2．5 一溴二胺标记的酪氨酸残基的质谱鉴定

3．3 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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