外源一氧化氮对盐胁迫下长春花生长及酚类代谢的影响研究

摘要

目前，全球土壤次生盐渍化范围不断扩大，程度逐渐加重，严重影响农业生产和生态环境，盐渍土的改良和植被恢复是国内外研究者关注的热点问题。一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种重要的信号分子，参与调控植物种子萌发、生长、发育和衰老等过程，同时在植物逆境响应中也发挥着重要作用。近年来研究表明，NO能通过改变植物代谢影响植物盐耐受性，但其调控基础还不清楚。长春花(Catharanthus roseus)因体内含有抗癌活性的生物碱类而备受关注。此外，大量研究表明长春花还富含酚类化合物，其中大部分酚类化合物因具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种药理功效，现已成为新药、先导化合物和新化学实体的重要来源。已有研究证实盐胁迫和外源氮素都可促进长春花体内生物碱含量的提高，但对于同样是次生代谢产物的酚类化合物鲜有报道。本研究在外源NO供体硝普钠(sodium nitropptusside，SNP)处理NaCl胁迫下长春花生长、生理指标等分析的基础上，利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)仪靶向分析NO对盐胁迫下长春花不同部位中酚类化合物组分及含量水平的变化，从代谢组水平揭示NO调控盐胁迫下酚类化合物的响应，为酚类代谢调控和NO提高长春花耐盐性机理奠定基础，并对盐碱地开发利用具有实践意义。主要研究结果如下:
　　(1)短时间(10d)25mM NaCl处理下长春花幼苗（木质部未分化）与对照差异不显著，甚至部分程度促进植株生长，浓度大于50mM NaCl时，与对照组差异显著，整体上看，NaCl抑制植株生长，且随着浓度的增大和时间的延长抑制效果越明显。长时间(85d)NaCl处理长春花幼苗（木质部已分化），NaCl胁迫15d内与对照相比各生长指标差异不显著，20d后开始有差异显著性。株高主要靠节数目的增加，节间距变化不明显，形成木质部的长春花幼苗，对盐胁迫有一定的抵御能力。
　　(2)NaCl浓度在100mM以下时，植株上、中、下叶片内脯氨酸(proline，Pro)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量平均值均低于对照组，叶面积、叶长、叶宽等生长指标与对照相比生长缓慢;125mM NaCl处理下Pro和MDA含量高于对照组，达到最高值，植株叶片面积、叶长、叶宽等生长指标表示明显抑制了植株生长。100-125mMNaCl浓度是严重影响植株生长的临界范围。
　　(3)SNP对盐胁迫下长春花种子萌发的影响实验中，50mM NaCl胁迫下的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、根长、芽长均低于正常对照，盐胁迫抑制了种子萌发;0.1mM SNP有效缓解盐胁迫对长春花种子萌发的抑制作用，甚至能恢复种子正常发芽率;大于0.5mM SNP会加重盐胁迫伤害，各项发芽参数、芽长、根长等均低于盐胁迫下。NO在盐胁迫下长春花种子萌发过程中起着重要的信号调控作用，低浓度缓解盐胁迫伤害，高浓度加重胁迫伤害。
　　(4)外源SNP有效提高盐胁迫下长春花叶片中硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)活性，4d后NR活性达到最高值，活性变化情况为4d＞5d＞3d＞2d＞1d;0.5mM SNP处理条件下NR活性最高，其中0-0.5mM SNP提升NR作用显著，1.0-2mMSNP作用下降。0.1mM SNP促进了Pro含量积累，降低了盐胁迫导致的MDA含量上升，可溶性糖含量达到最高，有效缓解盐胁迫引起的伤害，增强植株的耐盐性。
　　(5)SNP对盐胁迫下木质部成熟的长春花植株在生长指标上缓解效果不显著，其中125μM SNP明显抑制株高生长，且株高的改变主要靠降低节的个数来完成的，同时基茎明显增粗，植物靠降低高度增加茎粗度来提高对外界胁迫的抵御。NO作为一种信号分子参与调节气孔运动，SNP处理盐胁迫下长春花叶片下表皮气孔数量和开放数量增多，施加次数增多，变化幅度加大，0.1mMSNP处理气孔数量增加幅度最大。
　　(6)采用LC-MS技术分析SNP对盐胁迫下长春花根、茎、叶、花四个部位酚类物质种类和含量变化，鉴定出18种酚类物质和L-苯丙氨酸，按照化学结构式把18种酚类物质分成C6C1酚类5种:香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、原儿茶酸、没食子酸;C6C3酚类5种:对羟基肉桂酸、绿原酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸;C6C3C6（黄酮类化合物）8种:染料木素、木犀草苷、柚皮素、槲皮苷、杨梅苷、槲皮素、山柰酚、芦丁。其中槲皮素、绿原酸、原儿茶酸是长春花体内主要酚类物质，在不同部位中均有存在。
　　(7)不同浓度SNP处理后长春花不同器官酚类化合物响应积累呈现出明显不同的变化。根和茎中积累较多的小分子酚酸类化合物，而叶片以及花中则表现为C3C6C3型酚类化合物的明显富集，相比之下，根和茎中酚类化合物对盐胁迫及SNP处理的响应更敏感一些。
　　(8)酚类化合物在不同部位的分布明显不同，其中C6C3C6结构的黄酮类化合物在根、茎、叶、花中组成和相对含量差异较大，茎中8种黄酮类物质均有检出，而叶片中染料木素、木犀草苷、柚皮素和槲皮苷均未检出。槲皮素在不同部位相对含量均为最高，盐胁迫下茎、叶中含量上升，根和花中下降。
　　(9)75μM SNP(3＃)下植株没有开花，该处理组C6C1酚类化合物在叶中有香草酸和丁香酸出现，而其他开花植株叶片中未出现，酚类与植物成花的内在关系密切。

目录

摘要

1 绪论

1．1 长春花概述

1．2 盐胁迫对植物的影响

1．2．1 盐胁迫对植物生长发育的影响

1．2．2 盐胁迫对檀物光合生理的影响

1．2．3 盐胁迫对植物体内活性氧代谢的影响

1．3 NO在植物生长发育和逆境响应过程中的功能

1．3．1 NO在植物中的生物学功能

1．3．2 NO对植物生物胁迫的响应

1．3．3 NO对植物非生物胁迫的响应

1．4 代谢组学在植物抗逆研究中的进展

1．4．1 代谢组学及其研究方法

1．4．2 代谢组学在逆境生物学中的应用

1．4．3 代谢组学在植物次生代谢产物研究中的应用

1．4．4 酚类化合物生物学功能及其对逆境响应

1．5 本研究的目的及意义

2 盐胁迫对长春花耐受性的影响

2．1．2 实验设计

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 生长指标测定方法

2．2．2 茎切片形态学观察

2．2．3 脯氨酸含量的测定

2．2．4 丙二醛含量的测定

2．2．5 数据分析方法

2．3 实验结果

2．3．1 短时间盐胁迫对长春花幼苗的影响

2．3．2 长时间盐胁迫对长春花幼苗的影响

2．3．3 盐胁迫对长春花脯氨酸和丙二醛含量的影响

2．4 本章小结

3 外源NO对盐胁迫下长春花种子萌发及幼苗生长的影响

3．1．2 NO对盐胁迫下长春花幼苗生长影响

3．1．3 培养液及主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 种子萌发

3．2．2 生理指标的测定

3．2．3 其他实验方法

3．2．4 数据分析方法

3．3 实验结果与分析

3．3．1 外源NO对盐胁迫下长春花种子萌发的影响

3．3．2 外源NO对盐胁迫下长春花幼苗硝酸还原酶活性的影响

3．3．3 外源NO对盐胁迫下长春花幼苗脯氨酸含量的影响

3．3．4 外源NO对盐胁迫下长春花幼苗丙二醛含量的影响

3．3．5 外源NO对盐胁迫下长春花生长指标的影响

3．3．6 外源NO对盐胁迫下长春花幼苗叶绿素含量的影响

3．3．7 外源NO对盐胁迫下长春花幼苗可溶性糖含量的影响

3．3．8 外源NO对盐胁迫下长春花表皮气孔和茎切面的影响

3．4 本章小结

4 外源NO对盐胁迫下长春花酚类代谢的影响

4．1 实验材料及处理

4．1．1 实验材料

4．1．2 样品前处理与提取

4．1．3 仪器与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 色谱条件

4．2．2 质谱条件

4．2．3 数据分析方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 酚类化合物在不同器官中总体分布

4．3．2 C6C3酚类化合物在不同器官中的分布

4．3．3 C6C1酚类化合物在不同器官中的分布

4．3．4 C6C3C6酚类化合物在不同器官中的分布

4．3．5 L-苯丙氨酸在长春花不同器官中的分布

4．4 本章小结

结论

参考文献

附录1 色谱图

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明