锌指蛋白CG12744在果蝇肠道免疫中的功能研究

摘要

果蝇与哺乳动物不同，其只具备先天形成的免疫系统。肠道免疫作为果蝇天然免疫系统的重要组成部分已成为研究的重要课题。果蝇肠道免疫分为三个方面:首先，病原体刺激肠道后会引起肠道内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）产生;其次，当ROS无法有效清除病原体时，肠道会启动免疫缺陷信号转导途径（Imd pathway）分泌抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）;最后，肠道干细胞(intestinal stem cells，ISCs)不断增殖和分化以维持肠道内稳态。目前，果蝇肠道干细胞的增殖与分化信号转导途径研究的较为透彻，但锌指蛋白在果蝇肠道内稳态中的功能仍不十分清楚。
　　锌指结构域(zinc-finger domain)是普遍存在于DNA结合蛋白中的结构基元，其形成的结构像手指。大部分锌指蛋白是基因表达的调控者。CG12744基因含有一个C2H2类型的锌指结构域，其在果蝇基因组的定位为:2R:5762786...5763747。研究发现CG12744基因的产物具有结合金属离子及核酸分子的功能和抗真菌作用。此前研究发现锌指蛋白Charlatan(Chn)维持果蝇肠道内稳态，但CG12744基因在果蝇肠道免疫中的功能仍不清楚。因此，猜测该基因可能在调控肠道干细胞增殖与分化过程中发挥一定功能。
　　本研究主要以野生型果蝇w1118(WT)和CG12744基因低表达突变体果蝇为实验材料，利用革兰氏阴性菌Erwinia carotovora carotovora15（Ecc15）刺激果蝇肠道，主要通过免疫染色方法对果蝇生存率，肠道干细胞增殖与分化活性，肠道分泌肽的表达和脂肪合成等方面进行了研究，所得到的研究结论如下:
　　1.生存率
　　CG12744低表达突变体果蝇在喂食Ecc15后具有更高敏感性，该基因促使果蝇对Ecc15感染具有一定抗性，能够维持果蝇正常生存。
　　2.前体细胞数量
　　Ecc15感染肠道后，CG12744在前体细胞表达控制enteroblast(EB)细胞数量。与对照组比较，esgts Gal4＞CG12744RNAi果蝇EB细胞数量减少60％，但肠道干细胞数量无显著差异。无病原体感染时EB细胞数量无明显差异。CG12744对铜细胞区域内的前体细胞数量无影响。
　　3.分化
　　(1)肠道细胞分化结果表明esgtsGal4＞CG12744RNAi果蝇感染Ecc15后，enterocyte(EC)细胞分化存在明显缺陷。与对照组比较，EC细胞数量减少70％。
　　(2)CG12744基因与Notch信号无直接关系，但控制EC细胞内osa基因表达进而控制其分化。
　　(3)Ecc15感染后，与对照组比较esgtsGal4＞CG12744RNAi果蝇肠道JNK信号活性显著降低。
　　(4)喂食Ecc15后，CG12744在EB细胞表达控制enteroendocrine cell(EE)数量。与对照组比较，Su(H)Gal4＞CG12744RNAi果蝇EE数量增加了200％。
　　4.表皮结构
　　肠道形态分析显示CG12744在EC细胞表达维持了肠道细胞的形态和完整性。与对照组比较，NP1Gal4＞CG12744RNAi果蝇在病原体感染后肠道细胞形态发生异常，肠道细胞排列混乱，前体细胞细胞膜armadillo活性减弱，细胞核明显增大。
　　5.干细胞活性
　　感染条件下，CG12744在EE表达控制肠道干细胞增殖活性。与对照组比较，voilaGal4＞CG12744RNAi果蝇肠道干细胞增殖活性明显增强。
　　6.脂肪合成
　　Su(H)Gal4＞CG12744RNAi果蝇EE数量的增多引起肠道速激肽(tachykinin，TK)水平升高，进而导致肠道脂肪合成能力下降。
　　总而言之，当果蝇肠道遭受病原体Ecc15感染后，CG12744基因影响EB细胞数量和EC细胞及EE分化，维持肠道细胞形态的完整性;同时该基因对肠道速激肽的分泌和脂肪的合成具有一定功能。本研究为揭示果蝇以及哺乳动物肠道干细胞增殖与分化机制提供了必要的科学理论依据。

目录

摘要

绪论

1．1 引言

1．2．1 模式生物—黑腹果蝇

1．2．2 强大的遗传学可操作性

1．2．3 利用黑腹果蝇研究人类疾病的发病病理

1．3 果蝇肠道免疫研究进展

1．3．1 果蝇肠道的基本结构

1．3．2 果蝇肠道活性氧自由基的产生

1．3．3 抗菌肽分泌—果蝇肠道次级防御体系

1．3．4 果蝇肠道干细胞的增殖

1．3．5 果蝇中肠干细胞分化机制

1．3．6 果蝇肠道共生菌对干细胞增殖与分化的影响

1．4 锌指蛋白及果蝇CG12744基因的研究现状

1．4．1 锌指蛋白简介

1．4．2 果蝇CG12744基因研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 CG12744基因在果蝇肠道免疫中的功能研究

2．1．1 果蝇品系

2．1．2 实验室果蝇培养

2．1．3 实验菌株

2．1．4 Ecc15感染果蝇肠道时间点设定

2．1．5 肠道研究区域

2．1．6 果蝇培养基配制

2．1．7 果蝇杂交策略以及果蝇饲养

2．1．8 肠道免疫研究中的主要试剂

2．1．9 主要实验仪器

2．1．10果蝇基因组DNA提取

2．1．12 病原体Ecc15的培养

2．1．13 配制特定浓度的Ecc15病原体

2．1．14 病原体感染条件下的生存率实验

2．1．15 果蝇肠道常规免疫染色方法

2．1．16 Delta蛋白质染色

2．1．17 osa蛋白质染色

2．1．18 cut蛋白质染色

2．1．19 果蝇肠道TUNEL染色

2．1．20 果蝇肠道DHE染色

2．1．21 果蝇肠道Brdu染色

2．1．22 统计学分析

2．2 技术路线

2．3 结果与分析

2．3．1 CG12744突变体果蝇检测与验证

2．3．2 突变体果蝇生存率分析

2．3．3 喂食Ecc15后CG12744突变体果蝇肠道内稳态分析

2．3．4 病原体感染条件下CG12744基因控制肠内分泌细胞(EEs)分化

2．3．5 病原体感染条件下CG12744基因在EB内表达影响EE的分化

2．3．6 感染条件下肠道形态学分析

2．3．7 CG12744基因在EC细胞内表达控制肠道形态学发生

2．3．8 感染条件下CG12744基因在EE低表达引起干细胞增殖活性升高

2．3．9 感染条件下CG12744基因影响铜细胞分化

2．3．11 感染条件下CG12744控制活性氧自由基水平

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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