PdtWRKY86在杂交杨锈菌互作中的功能

摘要

杨树是世界上适应性最强、分布最广的树种。随着杨树人工林面积的不断扩大，我国现拥有世界上面积最大的杨树人工林。杨树是一个易发生病虫害的树种，其中危害杨树的致病菌株有300多种，我国报道存在的有110多种。在杨树叶部病害中，落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）引起的杨树叶锈病分布最广、危害最大。
　　通过落叶松杨栅锈菌E4强致病株系接种后两个杨树品种的症状及其间苯三酚染色判定杂交杨与E4锈菌互作为非亲和型互作，欧美杂交杨与E4锈菌互作为亲和型互作。以杂交杨为主要研究对象，欧美杂交杨作对照，对E4锈菌侵染后96h两个品种转录组数据进行分析发现，转录因子参与杂交杨应答E4锈菌侵染，其中NAC、WRKY、MYB、AP2和ERF所占比例较大。进一步对转录组数据中重要的5个转录因子家族进行分析发现，大部分WRKY转录因子在杂交杨应答E4锈菌12h和96h上调表达，起正向调控作用。
　　WRKY转录因子家族属于调控蛋白家族，是植物防御信号转导中至关重要的因子。以杂交杨转录组数据为基础，鉴定到100个PdtWRKY基因，其中99个PdtWRKY基因分别对应在毛果杨19条染色体上，PdtWRKY100定位于Scaffold_41。转录组数据分析表明杂交杨接种E4锈菌后有53个基因差异表达（8个基因下调，45个基因上调），选择上调表达的基因进行进一步研究。对45个基因进行靶基因预测，其中有28个基因找到相应的靶基因，共有305个靶基因，建立调控网络。对靶基因进行分类整理后，发现其中有21个靶基因具有转录因子活性，其中包括PdtWRKY64，它的上游基因为PdtWRKY86。PdtWRKY86在杂交杨接种E4锈菌后上调表达，转录调控唯一的靶基因PdtWRKY64，PdtWRKY64又转录调控18个基因，其中12个与植物抗病相关。由此表明PdtWRKY86具有多级调控网络，它的靶基因在杂交杨接种E4锈菌后也上调表达，因此筛选出Pdt WRKY86基因作为研究对象。
　　为明确PdtWRKY86基因在杂交杨与E4锈菌互作过程中的功能，克隆该基因、对7个时间点表达量进行分析并进行转基因验证。PdtWRKY86CDS全长为965bp，编码311个氨基酸。除6h外其余6个时间点均上调表达，表明PdtWRKY86在杂交杨与E4锈菌非亲和互作过程中起到正向调控作用。PdtWRKY86转基因拟南芥阳性植株较野生型拟南芥接种灰葡萄孢和致病疫霉后发病慢、病斑小，PdtWRKY86转基因拟南芥较野生型拟南芥抗病性强，表明PdtWRKY86转基因植物通过多级调控抗病相关基因的表达，提高转基因植物的抗病性。综上所述，证明PdtWRKY86是杂交杨-E4锈菌非亲和型互作过程的正向调控因子。

目录

摘要

1．1 植物抗病的防御机制

1．1．2 植物免疫机制

1．1．3 转录因子在植物抗病过程中的作用

1．2 植物转录因子概述

1．3．1 WRKY转录因子的结构特征

1．3．2 WRKY转录因子分类

1．3．3 WRKY转录因子的生物学功能

1．4 杨树叶锈病研究进展

1．5 转基因技术在植物抗病方面的应用

1．6 本研究的目的意义

2 杨树对E4锈菌抗病性分析及其转录组数据分析

2．1 试验材料及方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 E4锈菌接种杨树亲和型判定

2．2．2 接种E4锈菌后表达差异的杨树基因及GO富集分析

2．2．3 抗性相关转录因子表达差异分析

2．2．4 5个转录因子家族在E4锈菌接种后7个时间点表达量分析

2．3 讨论

3 PdtWRKY基因鉴定

3．1 试验材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 PdtWRKY基因鉴定

3．2．2 PdtWRKY系统发育树

3．2．3 PdtWRKY基因染色体定位

3．2．4 锈菌接种前后WRKY基因表达量差异分析

3．2．5 PdtWRKY基因靶基因鉴定与GO富集分析

3．2．6 PdtWRKY86的靶基因多级调控分析

3．3 讨论

4 PdtWRKY86基因克隆与表达分析

4．1 试验材料及方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 PdtWRKY86基因的克隆

4．2．2 PdtWRKY86基因生物信息学分析

4．2．3 E4锈菌接种后PdtWRKY86基因表达量分析

4．2．4 E4锈菌接种后PdtWRKY86基因靶基因表达量分析

4．3 讨论

5 转PdtWRKY86基因拟南芥抗病性分析

5．1 试验材料及方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 pBI121-PdtWRKY86载体构建

5．2．2 转基因拟南芥鉴定

5．2．3 转基因拟南芥抗病性验证

5．3 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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