水稻Ca2+依赖性核酸酶的生物学功能探究

摘要

核酸酶是一种能参与许多重要的分子生物学和生物技术、作用于磷酸二酯键的蛋白质。它广泛存在于各种生命体中，对于生物体的生长发育以及生理活动具有十分重要的意义。本研究以水稻Ca2+依赖性核酸酶OsCaN1、OsCaN3、OsCaN4基因作为研究对象，通过对其表达特性、亚细胞定位以及酶活性的分析并获得过表达植株从而对其生物学功能进行初步的探究。
　　首先利用实时荧光定量PCR对OsCaN1、OsCaN3、OsCaN4基因在野生型水稻不同组织中的表达量进行分析，同时探究了OsCaN基因在盐胁迫条件下的表达特性。结果表明OsCaN基因在成叶中的表达量最高，推测其是与衰老相关的基因;同时在盐胁迫处理下基因均受到诱导表达，推测OsCaN基因是与逆境胁迫相关的基因。
　　为了探究OsCaN蛋白表达的位置，通过基因枪将含有GFP标签的质粒转化至洋葱表皮，利用荧光显微镜观察OsCaN-GFP的亚细胞定位。结果表明OsCaN1-GFP、OsCaN3-GFP、OsCaN4-GFP融合蛋白均定位于细胞质中。
　　接下来为了探究水稻Ca2+依赖性核酸酶的酶活性，我们构建了OsCaN基因原核表达载体，经过诱导和纯化后得到GST-OsCaN融合蛋白并进行酶活性的检测。结果表明OsCaN蛋白在钙离子的协助下对环形质粒、双链DNA、单链DNA、mRNA、rRNA以及tRNA等底物具有降解能力，且金属螯合剂EDTA可以抑制核酸酶的酶活性，结果表明OsCaN基因属于Ca2+依赖性核酸酶。
　　为了更好地探究Ca+依赖性核酸酶OsCaN基因在水稻体内的功能，我们构建了基因的过表达载体，通过农杆菌侵染成功获得转基因水稻植株及种子，为接下来探究基因在水稻体内发挥的功能以及其在逆境胁迫下的应答机制奠定了基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 研究背景

1．1．2 核酸酶的作用条件

1．1．3 核酸酶的分类

1．1．4 核酸酶的底物特异性及其依赖的金属离子

1．1．5 核酸酶的亚细胞定位

1．2 核酸酶在生物体中的作用

1．3 研究进展

1．3．1 核酸酶的研究进展

1．3．2 钙离子依赖性核酸酶的研究进展

1．4 课题的研究目的与意义

2 水稻Ca2+依赖性核酸酶基因的表达特性分析

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 基因在水稻中的组织表达特异性分析

2．2．2 水稻在盐处理条件下基因表达分析

2．3 本章小结

3 水稻Ca2+依赖性核酸酶的亚细胞定位

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 水稻OsCaN基因的克隆

3．2．2 pCAMBIA-2300-GFP-OsCaN植物表达载体的构建

3．2．3 亚细胞定位分析

3．3 本章小结

4 水稻Ca2+依赖性核酸酶的酶活性分析

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 原核表达载体的构建

4．2．2 GST-OsCaN蛋白的诱导

4．2．3 GST-OsCaN蛋白的纯化

4．2．4 核酸酶的酶活性分析

4．3 本章小结

5 水稻Ca2+依赖性核酸酶过表达植株的获得

5．1 材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 过表达载体的构建

5．2．2 过表达水稻的表达分析

5．3 本章小结

6 讨论

6．4 水稻Ca2+依赖性核酸酶过表达植株的获得

6．5 待解决的问题

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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