白桦UV-B受体BpUVR8基因的克隆及功能研究

摘要

UVR8基因作为一种特异的UV-B光受体，在植物的光形态发生和发育过程中起着重要的作用。本研究从白桦中克隆获得UVR8基因，命名为BpUVR8(AHY02156)，并对其进行了生物信息学分析;研究了白桦BpUVR8基因的时空表达模式以及在各非生物胁迫以及激素信号诱导中的表达模式;同时通过克隆获得了白桦BpUVR8基因的启动子序列，并对其进行了生物信息学分析以及启动子活性分析的检测;构建了白桦BpUVR8基因的植物过表达载体，瞬时转化洋葱内表皮细胞，对其亚细胞定位进行了研究;同时通过蘸花法获得野生型以及拟南芥uvr8突变体背景下的白桦BpUVR8基因过表达转基因植株，利用uvr8突变体对BpUVR8基因的功能进行鉴定;此外，对BpUVR8基因在ABA信号通路中的作用进行了研究。主要结果如下:
　　1.白桦BpUVR8基因的生物信息学分析
　　通过克隆获得BpUVR8基因，生物信息学分析表明，白桦BpUVR8基因全长1326bp，编码441个氨基酸，其编码的蛋白为稳定性蛋白，具有四个跨膜区。二级结构分析表明该蛋白属于mixed型。三级结构预测结果显示，BpUVR8与AtUVR8蛋白具有较高同源性，均由7个β螺旋组成片层结构。
　　2.白桦BpUVR8基因的表达模式分析
　　qPCR结果表明，BpUVR8基因主要在白桦的叶片中高表达，表达量约为花序的6.5倍左右，其他部位表达量较少;从6月份开始，白桦BpUVR8基因的表达量成上升趋势，8月份该基因的表达量最高，约为6月份的两倍左右。表明BpUVR8基因的表达具有时空特异性。对白桦悬浮细胞进行非生物胁迫处理以及ABA信号诱导后，内源的BpUVR8基因均表现为明显的上调表达。表明BpUVR8基因对于非生物胁迫以及ABA激素信号诱导具有响应。基因亚细胞定位结果表明，白桦BpUVR8蛋白定位在细胞核和细胞膜上。
　　3.白桦BpUVR8基因的启动子的生物信息学及活性分析
　　通过克隆获得大小为2397bp的白桦BpUVR8基因的启动子片段，BpUVR8基因的启动子序列的生物信息学分析结果显示，该基因启动子除了含有多个光响应元件外，含有较多的激素响应的顺式作用元件以及响应生物和非生物胁迫诱导的顺式元件，将BpUVR8基因的启动子与报告基因GUS连接，并将pBpUVR8∷GUS重组载体瞬时转入烟草幼苗中，对转基因烟草进行GUS染色发现BpUVR8基因的启动子具有启动活性，且对转基因幼苗进行UV-B、NaCl、ABA和高温胁迫后，GUS基因均被不同程度的诱导表达，说明其启动子的活性可被UV-B、NaCl胁迫以及ABA激素信号诱导。
　　4.白桦BpUVR8基因与拟南芥uvr8突变体的功能互补
　　功能互补实验表明白桦BpUVR8基因能恢复拟南芥uvr8突变体的表型，在植物体内具有调控UV-B光形态建成的作用，表明BpUVR8基因是UV-B诱导的植物光形态发生的正调控因子。酵母双杂交实验表明BpUVR8蛋白与BpCOP1蛋白具有相互作用。为进一步研究白桦中光信号转导的分子机制指明了方向。
　　5.白桦BpUVR8基因在ABA信号通路中的作用
　　在自然光以及UV-B辐射下，35S∷BpUVR8/WT转基因拟南芥植株在种子的萌发和生长阶段均表现出来了对ABA超敏的表型。此外在转基因拟南芥以及转基因白桦中，BpUVR8基因的表达变化均影响了拟南芥以及白桦中ABA信号转导通路相关调节基因的表达。

目录

摘要

1 绪论

1．1 UV-B和植物的生长发育

1．2 UV-B受体UVR8的研究进展

1．3 UV-B辐射与其他环境因子的复合作用

1．4 UV-B辐射与ABA

1．5 研究的目的意义

2 白桦BpUVR8基因的克隆与生物信息学分析

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 白桦组培苗总RNA的提取

2．2．2 白桦cDNA的合成

2．2．3 BpUVR8基因全长序列cDNA的克隆

2．2．4 生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 白桦BpUVR8基因核酸组成成分分析

2．3．2 氨基酸的理化性质分析

2．3．3 白桦BpUVR8蛋白的一级结构预测

2．3．4 蛋白质二级结构分析

2．3．5 蛋白质的三级结构分析

2．3．6 基因同源进化分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 白桦BpUVR8基因的表达模式分析

3．1 材料

3．2 方法

3．2．6 实时荧光定量PCR

3．2．7 白桦BpUVR8基因亚细胞定位的研究

3．3 结果与分析

3．3．3 UV-B诱导白桦BpUVR8基因的表达分析

3．3．5 白桦BpUVR8蛋白的亚细胞定位

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 白桦BpUVR8基因启动子的克隆与分析

4．1 材料

4．2 方法

4．2．1 白桦基因组DNA的提取

4．2．2 启动子生物信息学分析

4．2．3 启动子活性及非生物胁迫诱导响应分析

4．3 结果与分析

4．3．1 白桦BpUVR8基因启动子序列元件分析

4．3．2 白桦BpUVR8启动子在烟草中的表达活性

4．3．3 非生物胁迫下白桦BpUVR8基因启动子的表达活性

4．4 讨论

4．5 本章小结

5 白桦BpUVR8基因在拟南芥uvr8突变体中的功能互补

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 质粒的提取

5．2．2 白桦BpUVR8基因的载体构建

5．2．3 转基因植物材料的获得

5．2．4 拟南芥阳性植株的鉴定

5．2．5 拟南芥相关指标的测定

5．2．6 酵母双杂交

5．3 结果与分析

5．3．1 转基因拟南芥植株的DNA检测

5．3．3 白桦BpUVR8基因与拟南芥uvr8突变体的功能互补

5．3．4 白桦BpUVR8蛋白与BpCOP1蛋白互作

5．4 讨论

5．5 本章小结

6 白桦BpUVR8基因在ABA信号通路中的作用

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 拟南芥的培养

6．2．2 BpUVR8基因过表达转基因拟南芥的ABA表型分析

6．2．3 生理生化指标的测定

6．2．4 在低剂量的UV-B下35S∷BpUVR8/WT转基因拟南芥对ABA的响应

6．2．5 基因表达

6．2．6 白桦BpUVR8基因在白桦中对ABA的响应

6．3 结果与分析

6．3．1 白桦BpUVR8基因异源过表达拟南芥植株对ABA敏感性增加

6．3．2 35S∷BpUVR8/WT转基因拟南芥相对电导率及MDA的含量升高

6．3．3 35S∷BpUVR8/WT转基因拟南芥超氧阴离子的含量升高

6．3．4 在低剂量的UV-B下35S∷BpUVR8/转基因拟南芥对ABA的响应

6．3．5 BpUVR8基因调节ABA响应基因和转录因子HY5的表达

6．3．6 BpUVR8调控白桦中ABA响应基因和转录因子HY5的表达

6．4 讨论

6．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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