特异性产牡荆苷木豆内生真菌Dichotomopilus funicola Y3的发酵工艺优化及其生物活性研究

摘要

植物内生真菌能够产生具有多种生物活性的代谢产物，同时也可以产生与宿主相同或结构类似的成分，被认为是农业、工业和医学领域具有巨大价值的新化合物的宝库。
　　牡荆苷(Vitexin)是豆科木豆属植物木豆中的主要有效成分，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血压、细胞增殖等作用。临床上用于治疗心脑血管疾病，对缺血性心肌损伤具有良好的保护作用，其机理是增加冠状动脉的血流量、降低射血阻力及血浆粘度、提高RBC的变性能力、抑制血栓形成。目前，牡荆苷主要从植物中提取，含量低、工艺复杂和不易纯化。
　　本试验以本课题组前期从木豆中分离并筛选出的产牡荆苷的内生真菌Y3为材料，鉴定内生真菌Y3的种属并申请Gen Bank号，为开发牡荆苷来源提供更多新的候选资源;为了适应工业化生产，对产牡荆苷内生真菌进行优化培养，以提高牡荆苷产量;并进行了内生真菌Y3发酵液牡荆苷提取物的抗氧化作用及其促进成骨细胞MC3T3-E1增殖作用的研究。试验取得如下结果:
　　1.根据菌落形态及显微形态的观察结果，将菌株Y3初步鉴定为毛科菌属Chaetomidium sp。在此基础上，对其ITS片段进行扩增并测序，得到长度为558bp的DNA片段，在NCBI数据库中进行ITS序列同源性比对，Y3的ITS序列和NCBI中收录的Dichotomopilus funicola(EF017204)ITS序列同源性为99％，结合形态学特征和分子生物学鉴定结果将菌株Y3鉴定为Dichotomopilus funicola，并得到Genbank登录号为MF800960。
　　2.首先，以原始培养基为基础，通过单因素实验筛选出有利于牡荆苷合成的碳源、氮源、温度和pH，初步确定了发酵培养产牡荆苷的基本条件为葡萄糖20g/L、氯化铵8g/L、温度为30℃、pH=7，并且通过两周的培养确定其最佳培养时间为8天;然后，利用Plackett-Burman设计筛选出能诱导牡荆苷产量增加的显著诱导因子;最后，采用中心组合设计(CCD)实验拟合出产量与显著性诱导因素间的多元回归关系，并预测出理论极值且通过实验验证。最终，优化培养基中添加的诱导因子为L-苯丙氨酸0.06g/L，水杨酸0.21g/L，硫酸铜0.19g/L。预测牡荆苷产量为79.49mg/L，在上述优化培养条件下对其进行验证实验，牡荆苷产量为79.15mg/L，是原始水平的4.61倍。
　　3.通过清除OH活性测定和清除DPPH活性测定，对内生真菌Y3发酵产物牡荆苷粗提物的抗氧化活性进行研究。试验结果表明:木豆内生真菌Y3发酵液中的牡荆苷粗提物拥有较高的DPPH自由基清除能力，清除率最高达94.42％，且高于同等浓度下Vc的清除率，计算得到其IC50=164μg/mL;同时也具有较强的OH清除能力，最高达到53.12％，且高于同等浓度下Vc的清除能力，计算得其IC50=5.32mg/mL。
　　4.MTT法是通过细胞代谢来检测细胞增殖。本实验为研究内生真菌产牡荆苷提取物对成骨细胞MC3T3-E1促进增殖的效果，以牡荆苷标准品为阳性对照，木豆产内生真菌粗提物为待测样品探讨其不同浓度、不同作用时间对颜色深浅的影响，确立了最佳的检测条件。结果如下:产牡荆苷内生真菌对成骨细胞MC3T3-E1的增殖产生不同程度的影响，从时间和浓度梯度来看，药物浓度为10-4μg/mL的内生真菌产牡荆苷发酵液粗提物对细胞作用24h时的增殖效果最显著，最大增殖率达到24.39％。
　　综合以上研究结果，从木豆内生真菌中筛选到产牡荆苷的活性菌株，进行了形态学和分子学的鉴定确定其种属;通过发酵优化大大提高了其牡荆苷的产量;并且研究表明其牡荆苷粗提物不仅具有较强的抗氧化，而且对小鼠成骨细胞MC3T3-E1具有一定的增殖作用。本论文的研究成果丰富了牡荆苷提取来源和方法，非常值得开发利用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 木豆研究概况

1．1．1 木豆简介

1．1．2 木豆主要化学成分及其药理作用

1．2．1 牡荆苷简介

1．2．2 牡荆苷药理活性

1．3 植物内生真菌

1．3．1 植物内生真菌简介

1．3．2 植物与内生真菌相互作用

1．3．3 内生真菌代谢产物及其生物多样性

1．4 微生物发酵常用的优化方法

1．4．1 单因素实验

1．4．2 Plackett-Burman实验

1．4．3 响应面实验设计

1．5 本研究的目的和意义

2 特异性产牡荆苷木豆内生真菌Y3的鉴定

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 培养基的配制

2．2 实验方法

2．2．1 内生真菌Y3的形态学鉴定

2．2．2 内生真菌Y3的分子生物学鉴定

2．2．3 木豆内生真菌的系统发育分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 形态学鉴定结果

2．3．2 分子生物学鉴定结果

2．4 本章小结

3 特异性产牡荆苷木豆内生真菌Dichotomopilus funicola Y3的发酵工艺研究

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．1．4 主要培养基和试剂的配制

3．2．1 制备种子培养液

3．2．2 内生真菌Y3发酵液中牡荆苷的提取

3．2．3 牡荆苷的检测及标准曲线的绘制

3．2．4 产牡荆苷内生真菌Y3发酵工艺优化

3．3 结果与讨论

3．3．1 牡荆苷标准曲线的绘制

3．3．2 碳源对牡荆苷产量的影响

3．3．3 氮源对牡荆苷产量的影响

3．3．4 pH值对牡荆苷产量的影响

3．3．5 温度对牡荆苷产量的影响

3．3．7 Plackett-Burman设计筛选显著诱导因子

3．3．8 单因素优化实验

3．3．9 响应面优化设计及结果

3．4 本章小结

4 内生真菌Dichotomopilus funicola Y3牡荆苷提取物抗氧化活性的研究

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验试剂

4．2．1 主要试剂的配置

4．2．2 抗氧化活性测定

4．3．1 清除DPPH活性测定结果

4．3．2 清除·OH活性测定结果

4．4 本章小结

5 内生真菌Dichotomopilus funicola Y3牡荆苷提取物对MC3T3-E1成骨细胞增殖作用的研究

5．1．1 实验仪器

5．1．2 实验试剂

5．2 实验方法

5．2．1 实验前准备

5．2．2 主要试剂的配制

5．2．3 样品贮存液配制

5．2．4 MC3T3-E1细胞的传代、冻存及复苏

5．2．5 MTT法检测内生真菌Y3提取物对成骨细胞增殖作用研究

5．3．1 内生真菌D．funicola Y3牡荆苷提取物对成骨细胞增殖效果的影响

5．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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