洛美沙星和阿莫西林多克隆抗体的制备及Ci-ELISA检测方法的初步研究

摘要

洛美沙星(LMF)和阿莫西林(AMX)分别属于氟喹诺酮类和p-内酰胺类抗生素，目前在临床兽药上应用十分广泛。二者在畜禽食品中的残留都会引起一系列后果，例如诱导耐药菌株的产生、敏感人群产生过敏反应等。因此，针对二者残留的快速检测方法的建立对控制动物性食品的卫生质量、保障消费者健康等方面都具有比较重要的社会和经济意义。 本研究旨在建立畜禽产品中洛美沙星和阿莫西林残留的间接竞争酶联免疫吸附(Ci-ELISA)检测方法。研究内容和结果如下： 1.通过两种方法一碳二亚胺法和混合酸酐法分别把洛美沙星与阿莫西林两种半抗原和载体蛋白牛血清白蛋白与卵清蛋白偶联制备免疫原(LMF-BSA,AMX-BSA)和包被原(LMF-OVA,AMX-OVA)。制备的人工抗原经紫外扫描和免疫动物实验进行了鉴定，结果表明：偶联物的紫外吸收光谱明显具有药物和载体蛋白叠加的特征；通过免疫BALB／~小鼠制备抗血清利用ELISA方法进行检测也证明了免疫原和包被原的成功合成。 2.为了制备较多量的多克隆抗体，分别用LMF-BSA和AMX-BSA作为免疫原免疫新西兰纯种白兔。制备的抗血清分别用间接ELISA和间接竞争ELISA检测效价和特异性，结果如下：洛美沙星抗血消终点效价在l：640000以上，并且特异性良好；阿莫两林抗血清终点效价在l：64000左右，但是特异性不理想，经进一步试验验证表明，抗体更多的针对阿莫西林分解产物，究其原因是因为免疫原AMX-BSA在免疫过程中已发生部分分解所致。 3.通过优化条件，初步建立了洛美沙星的Ci-ELISA检测方法。选取的检测优化条件为：抗血清稀释度为1：40000，封闭液为l％的酪蛋白溶液，包被原LMF-OVA的稀释度为1：1000，辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG(HRP-IgG)稀释度为l：10000。检测结果如下：回归线性方程为y=-0.2865x+0.3689，相关系数R=0.9962(其中y为B／Bo，x为lg[LMF])，线性范围在0.05gg／ml-5~tg／ml之间，检测限为0．024Bg／ml。高低中二个浓度的批内和批间相对标准偏差的平均值分别为17．7％和23．2％，牛奶样品中的回收率在85％一120％之间。 4．本实验对洛美沙星残留的的高效液相检测方法也作了一定的研究，建立了标准品和牛奶样品中洛美沙星的HPLC测定方法，结果如下：对洛美沙星标准品求得的回归方程为：H=7．0763c-0.3918(H表示峰高，c表示浓度)，R=0.9999，线性范围为：O.1μg／ml一100μg／ml，检测限为O.062μg／ml(S／N=3)；对牛奶样品用甲醇作处理后进样检测，求得的回归方程为：H=5.0733c+0.3207，R=0.9999，线性范围为0.1μg／ml-200μg／ml，检测限为0.21μg／ml(S／N=3)，提取回收率在70％-80％。以HPLC为标准参比方法验证Ci-ELISA方法的可靠性，求得的回归方程为：Y=0.9985X+0.0202，相关系数R=0.9896(n=11)，表明两种方法相关性良好，Ci-ELISA法可实际应用于洛美沙星残留的测定。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

第1部分文献综述第1章兽药残留及监控

第1部分文献综述第2章兽药残留检测技术

第1部分文献综述第3章洛美沙星作用机理、残留毒性与限量标准

第1部分文献综述第4章阿莫西林作用机理、残留毒性与限量标准

第2部分研究内容第1章半抗原多克隆抗体的制备与鉴定方法

第2部分研究内容第2章洛美沙星和阿莫西林人工抗原的合成与鉴定

第2部分研究内容第3章洛美沙星和阿莫西林多抗的制备和性质鉴定

第2部分研究内容第4章洛美沙星间接竞争ELISA检测方法的初步建立

第2部分研究内容第5章洛美沙星的高效液相检测方法的建立和与ELISA方法的比较

第2部分研究内容第6章结论

参考文献

硕士期间发表及待发表的文章

致谢