CYR61、CTGF和WISP-1在肺癌组织中的表达及莱菔硫烷对CYR61的影响

摘要

肺癌已成为世界上主要的肿瘤死因之一。而且多数证据显示：CCN蛋白参与肿瘤发生过程，在多种肿瘤中发现CCN蛋白上调或下调表达，提示CCN蛋白表达对肿瘤的发生起正向或负向的调节作用。人肺癌细胞株研究证实，CYR61和CTGF抑制肺癌细胞的转移和浸润，并视为肿瘤抑制因子。CYR61是非小细胞肺癌细胞的生长抑制因子，通过上调p53触发信号通路抑制非小细胞肺癌的生长。WISP-1和WISP-2在Wnt信号调节过程中起下调作用。莱菔硫烷(SFN)是十字花科植物中含有的一种异硫氰酸盐，在绿花椰菜中含量最多。SFN在肿瘤发生的多个阶段发挥抑制作用，而且还是潜在的肿瘤治疗药物。SFN与肿瘤的关系研究正成为肿瘤学和营养学研究的热点。 本次实验，通过实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)和免疫组化方法分析CYR61、CTGF和WISP-1三种基因在肺癌原发灶及匹配正常肺组织中的表达和临床病理参数关系，通过MTT和FQ-PCR分析SFN干预对A549细胞株CYR61基因表达的影响，探讨SFN对A549细胞的作用。 实验方法1.对象选择、组织样本的采集与病人相关病例的整理 选取2002年至2005年在郑州大学第一附属医院就医的肺癌患者作为研究对象，采集手术后患者肺癌原发灶及其匹配的正常肺组织有效标本60对。大多数标本离体后不超过1h，均放在-70℃冰箱中冷冻保存。收集病人的性别、年龄、吸烟情况、结核病史、发病部位、病理类型、肿瘤大小、临床分型等方面的临床资料，便于统计分析和研究。 2.采用Trizol试剂提取人体肺癌患者组织标本和A549细胞株RNA。通过1％的琼脂糖凝胶电泳及RNA的OD值评估RNA含量和纯度。 3.使用Promega公司的AMV逆转录试剂盒进行cDNA的反转录。RT-PCR扩增β-actin检测逆转录效果。 4.CYR61、CTGF和WISP-1三种基因在肺癌原发灶及匹配正常肺组织中表达量分析。FQ-PCR利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析；免疫组化方法分析CYR61、CTGF和WISP-1三种基因编码蛋白的表达情况。 5.用MTT法检测SFN对A549细胞的抑制效应，计算不同浓度SFN对A549细胞的50％抑制率。摸索SFN对A549细胞的有效干预时间点和有效作用浓度区间。然后用SFN对体外培养的A549肺癌细胞株进行处理，最后用FQ-PCR技术检测SFN对体外培养的A549肺癌细胞株CYR61表达的影响。 6.统计学分析对每个样本来说，用dCt(Ctβ-actin-CtcYR61)值表示目的基因与内参基因β-actin间Ct的差值，ddCt值等于dCt(experimentalsample)-dCt(calibratorvalue)。对ddCt采用正态性检验。 对肺癌样本每种基因的表达和家族史、转移、吸烟、肿瘤分级、肿瘤病理、肺结核、性别、肿瘤位置、肿瘤大小和患者年龄等单个临床参数间的关系采用t-检验和方差分析。采用Pearson相关分析，通过量化三种基因的表达结果估计相关程度，按0.05水准双侧概率确定结果有无统计学意义。采用多元线性回归分析，分析基因表达的影响因素。 采用Mias2000图象分析系统对免疫组化结果进行半定量分析。用卡方检验分析肺癌患者原发灶及其配对正常肺组织的表达阳性率的差异。 采用单因素方差分析，分析SFN干预前后A549肺癌细胞株CYR61基因表达量的差异。 结果1.FQ-PCR结果显示：80％(48/60)的肺癌原发灶标本CYR61基因的表达低于其匹配的正常肺组织标本；65％(39/60)的原发灶标本CTGF基因的表达低于其匹配的正常肺组织标本；83％(50/60)的原发灶标本WISP-1基因的表达高于其匹配的正常肺组织标本。 2.CYR61多元线性回归分析显示：CYR61基因表达主要受AC，SC和年龄的影响，其次受CTGF基因表达、吸烟、有无转移的影响，最后是左上位和家族史的影响。年龄和左上位起负调节作用，AC、SC、CTGF、吸烟、转移和家族史是正调节因子，这些自变量的联合作用促使肺癌组织CYR61基因的表达低于配对的正常肺组织。 3.CTGF多元线性回归分析显示：右上位、CYR61的表达水平、左上位、左下位、性别、吸烟、SC以及WISP-1的表达水平以逐步递减的方式影响CTGF基因的表达，CYR61基因的表达水平、性别、吸烟和SC是危险因素，WISP-1基因的表达水平、左上位、左下位、右上位是保护因素。 4.WISP-1多元线性回归分析显示：WISP-1基因表达主要受ASC的影响，其次受年龄和家族史的影响，很少受转移、腺癌、性别、CTGF基因表达量的影响，危险因素来自腺鳞癌、家族史和腺癌，保护因素有年龄、转移、性别及CTGF基因表达水平。 5.MTT结果显示：SFN从40μM的浓度起开始出现细胞抑制效应，随着浓度的升高呈现剂量依赖效应，浓度越高抑制率越大；且40μM、80μM、100μM和160μMSFN等较大剂量不同浓度干预组在8h、16h、24h和32h等不同作用时间点具有时间效应关系，干预时间越长，抑制率越大。 6.光镜下细胞形态：A549细胞培养32h后，溶剂对照、阴性对照及12.5μM的SFN处理组细胞形态学变化不明显；25μM的SFN处理组部分细胞皱缩、变圆，折光性上升；50μM的SFN处理组皱缩细胞数目增多；75μM的SFN处理组细胞皱缩数目增多，部分细胞漂浮，并可见细胞碎片。 7.25μM和50μM浓度SFN干预组的CYR61基因表达量较高，按α=0.05检验水准双侧概率，25μMSFN组与50μMSFN组之间差异没有统计学意义，25μMSFN组和50μMSFN组与其它各组相比，差异有统计学意义。75μM浓度SFN干预组的CYR61基因表达低于50μM浓度SFN干预组。 结论1.本研究通过对肺癌患者原发灶标本及其匹配的肺正常组织标本基因表达分析认为，CYR61和CTGF抑制肺癌细胞的转移和浸润，为抑癌基因，WISP-1为癌基因。2.CYR61、CTGF和WISP-1基因的表达与临床病理参数相关。CYR61基因的表达主要受AC、SC和年龄的影响，CTGF基因的表达主要受右上位、CYR61基因的表达水平、左上位的的影响，WISP-1基因表达主要受ASC的影响。 3.SFN在一定浓度下对A549细胞株起抑制作用，在观察的时间浓度范围内，存在明显的时间效应关系和剂量效应关系，干预时间越长抑制率越大，干预浓度越大抑制率越大。 4.SFN在25μM和50μM浓度组对A549细胞株CYR61基因的表达起促进作用。

目录

论文说明：英文缩略词

郑重声明

引言

第一部分CYR61、CTGF和WISP-1在肺癌组织中的表达

第二部分莱菔硫烷对A549肺癌细胞株CYR61的影响

结论

参考文献

CCN家族与肿瘤关系的研究进展

致谢