肿瘤细胞总RNA转染的人脐血树突状细胞分泌的exosomes抗肿瘤效应研究

摘要

背景和目的；树突状细胞(dendriticcell，DC)是一类专业的抗原递呈细胞，在体内具有强大的激发初次免疫和再次免疫的能力。已有研究发现树突状细胞除了通过细胞间直接接触和分泌细胞因子参与机体免疫调节的作用方式之外，还可通过分泌具有抗原递呈能力的囊泡状小体exosomes来诱导T细胞免疫反应。Exosome是直径为30nm-100nm的囊泡状小体，许多细胞都具有分泌exosome的能力，例如肥大细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、血小板、肿瘤细胞以及树突状细胞等。Exosome内部富含MHCⅠ和MHCⅡ类复合体、T淋巴细胞共刺激分子等。 有报道称肿瘤抗原肽冲击的树突状细胞分泌的exosomes可在小鼠体内特异性的激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，抑制肿瘤的生长，甚至能彻底消灭小鼠体内肿瘤细胞。以exosomes为基础的亚细胞结构的肿瘤疫苗提供了一种可以替代树突状细胞的肿瘤生物治疗模式。 在体外，用肿瘤细胞总RNA转染树突状细胞能够激发出强大的、T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应。本实验提取人胃腺癌BGC-823细胞和人白血病K562细胞总RNA，转染人脐血来源的树突状细胞后，提取树突状细胞培养上清液中的exosomes，观察其能否诱导出特异性抗肿瘤效应。 方法；1脐血来源DC体外诱导扩增采用四步梯度离心法从脐血中分离单个核细胞(MNC)后，以含10％胎牛血清的RPMI1640培养，2h后贴壁细胞为单核细胞，加入细胞因子rhGM-CSF(50ng/m1)，rhIL-4(10ng/ml)诱导分化。 2T细胞的分离和诱导方法1中非贴壁细胞用含10％胎牛血清RPMI1640培养液培养，并加入rhIL-2(5ng/ml)。 3总RNA制备及鉴定参照RNA提取试剂Trizol说明书将处于对数生长期的BGC-823细胞和K562细胞抽提总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，紫外分光光度仪测定A260/A280数值。 4总RNA转染DC参照阳离子脂质体LIPOFECTAMINE2000试剂说明书，用肿瘤细胞总RNA转染DC。 5转染后DC行透射电镜分析。 6转染前后DC表面标志变化取转染前培养5d未成熟DC及培养第8d分别转染两种肿瘤细胞总RNA后DC，流式细胞仪(FCM)检测DC表面标志性标志物CD54、CD80、CD86、HLA-DR的表达水平。 7四步离心法提取exosomes。 8exosomes的透射电镜分析滴20-30μlexosomes悬液于载样铜网上，室温静置1h，用滤纸从侧面吸干液体，滴加20ml/L磷钨酸溶液约30μl于铜网上，室温负染1min，滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约10min,透射电镜下观察照相。 9MTT法检测exosomes激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性exosomes激活的CTL作为效应细胞，肿瘤细胞作为靶细胞，效靶比分别为10：1和20：1。并设效应细胞对照组和靶细胞对照组，每组均设3个复孔。杀伤活性=[靶细胞对照组A值-(实验组A值-效应对照组A值)]/靶细胞对照组A值×100％。 10采用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，所获数据均用±s表示，组间比较采用配对t检验。 结果；1培养8d后，通过光镜和透射电镜观察可见典型的树突状细胞形态。 2通过紫外分光光度计测得OD260/280=1.87，证明提取的RNA较为纯净。经RNA电泳，呈现5S，18S，28S3条完整条带而无其他杂带干扰，也无拖尾现象，证明RNA未降解。 3DC转染后72h，在CD54、CD80、CD86、HLA-DR等成熟标志的表达上均有显著升高。 4MTT法检测exosomes激活的CTL和未经exosomes激活的CTL对BGC-823细胞和K562细胞的杀伤率，激活组杀伤率明显高于未激活组，证明RNA转染DC泌exosomes具有强大的激活CTL的能力。 结论；通过本实验的研究，可得出如下结论：转染了肿瘤细胞总RNA的DC分泌的exosomes具有强大的激活CTL的能力，经实验证明，激活的CTL在体外对肿瘤细胞有特异性杀伤活性，无论是实体瘤细胞和血液病细胞均有明显作用。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

1引言

2材料和方法

3实验结果

4讨论

5.结论

参考文献

综述Exosomes的来源、特性与功能

缩略语

致谢