安阳地区HPV感染和p53基因第72密码子多态性及其突变与食管癌的相关研究

摘要

食管癌是人类最常见的肿瘤之一，在不同的国家、种族之间有不同的发病率和死亡率。中国是全世界食管癌发病率和死亡率最高的国家，特别在农村地区，食管癌严重威胁着人民的健康。大量流行病学调查初步明确了亚硝胺、营养因素等是食管癌的主要病因因素。1982年，Syrjanen等发现食管癌的组织学形态改变和人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染的生殖道湿疣改变相似，提出了HPV感染可能与食管癌有关。此后，关于食管癌中检测HPV感染的研究大量涌现，但检测结果差别非常大，甚至有感染率为0％和100％的报道。其可能原因有①标本来自不同的地区，其感染率本来就存在差异；②检测的方法不同，不同的方法有不同的敏感度和准确度，其中以PCR方法较为敏感，但不同引物得到的感染率也差别很大；③取材部位的不同，HPV仅在高分化的上皮细胞内复制，而在中分化和低分化的组织中处于潜伏状态，其拷贝数相差很大，对结果有一定影响。河南安阳地区是食管癌的高发区，很多科研工作者对该区HPV感染与食管癌的关系作了研究，但结果也不一致，因此尚有待于确定HPV感染是否为该区食管癌高发的病因之一。 p53基因是重要的抑癌基因之一，与细胞周期调控、细胞凋亡等重要生物学功能有关。p53的突变是许多肿瘤中最常出现的事件之一，有统计表明，约有50％的人类肿瘤中可检测出p53的基因突变。研究表明，p53基因第4外显子72密码子存在CGC/CCC两种单核苷酸多态，使得编码的精氨酸(Arg)被脯氨酸(Pro)取代。这种多态性在食管癌发生发展中的作用尚不清楚，但有研究表明，Arg纯合子基因型在HPV相关食管癌中有较高的检出率，可能是HPV相关食管癌的易感因素。但是，以往研究多是将患者癌组织与正常人群该位点的多态性分布相比较，而对于同一个体中，该位点在癌组织中与血液标本中相比是否发生了突变，鲜有报道。 本研究旨在通过分析安阳地区HPV感染、p53第72密码子多态性在食管癌患者中的分布情况，以及p53基因第4外显子72密码子的多态性在患者血液和癌组织标本中是否有差异及其产生的可能原因，以探讨该区食管癌发生与HPV感染和p53基因第72密码子多态性及其突变之间关系，并为进一步的该区食管癌病因和发生机制的研究提供依据。 方法；1.标本来源：癌组织取自安阳肿瘤医院就诊的食管癌患者新发病例手术切除标本；血液为患者静脉血，抗凝，与癌组织一起于-80℃冰冻保存。一般资料采取问卷法在患者术前进行。 2.基因组DNA的提取：(1)癌组织：取约20mg冰冻癌组织，用酚、氯仿法提取基因组DNA；(2)血液：取200μl全血细胞于1.5mlEp管中，用酚、氯仿法提取基因组DNA。 3.HPV的检测：用上述提取的基因组DNA作模板，分别用针对HPV的晚期基因L1的通用引物GP5+/6+和针对HPV16的E6基因的特异性引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测HPVDNA。 4.p53基因第72密码子的多态性检测：对提取的基因组DNA，采用PCR-RFLP(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)法检测血液和癌组织标本中p53基因第72密码子的多态性分布情况。 5.结果分析方法：对以上实验所得数据输入VisualFoxPro6.0建立数据库，用SAS9.13统计软件包进行分析。 结果；1.在104例食管癌患者中HPV的检出率分别是60.58％(通用引物GP5+/6+)和49.04％(HPV16E6特异性引物)，而在正常对照中，两种引物检测HPV的感染率均为16％。经统计学分析，χ2=16.04，P＜0.0001(通用引物)；χ2=9.00，P=0.0027(特异性引物)，差异均具有统计学意义。进一步分析发现HPV16感染和患者性别、年龄、家族史、吸烟、饮酒等危险因素以及肿瘤分级、肿瘤位置、是否有淋巴结转移等临床特征之间均无相关性。 2.p53基因第72密码子在患者癌组织、血液标本及正常对照中三种基因型的频率分别为：癌组织标本：Pro/Pro基因型占18.27％，Arg/Arg基因型占45.19％，Pro/Arg基因型占36.54％；患者血液标本：Pro/Pro基因型占19.23％，Arg/Arg基因型占43.27％，Pro/Arg基因型占37.5％；正常对照：Pro/Pro型20％、Arg/Arg型20％、Pro/Arg型60％。统计学分析显示三者差异均无显著性。以是否有HPV16感染分组，分别分析三种不同形式标本中各基因型的分布频率，发现癌组织中分布差异有统计学意义(χ2=8.77，P＜0.05)，而在患者血液标本和正常对照中差异均无统计学意义。 3.在104例食管癌患者中，p53基因第72密码子有10例发生了突变，突变率为9.62％。以HPV16是否感染分组，未发现两组突变率有差异(χ2=0.22，P=0.7417)。 结论；1.食管癌患者中HPV感染率明显高于对照组，提示HPV感染可能是该区食管癌高发的病因之一。但HPV感染和性别、年龄、家族史、吸烟、饮酒等因素之间无关，是相互独立的；且HPV感染和患者临床特征无关。 2.p53基因第72密码子在患者癌组织、患者血液和正常对照中的分布差异无统计学意义，尚不能确定Arg/Arg基因型是该区食管癌的易感因素。癌组织中Arg/Arg基因型在HPV感染阳性组明显高于HPV感染阴性组，提示在安阳地区Arg/Arg基因型可能是HPV相关食管癌的易感因素。 3.在食管癌患者的癌组织中有p53基因第72密码子突变现象的存在，可能与食管癌的发生有关。但该位点的突变可能和HPV感染无关。

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小结

参考文献

人乳头瘤病毒及其与食管癌关系的研究进展

致谢

附录

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