干扰素a、恩替卡韦和胸腺肽a1对慢性乙肝患者树突状细胞功能的体外影响

摘要

背景和目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B vires，HBV)感染是一全球性的公共健康问题，我国是乙型肝炎高流行国家。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者往往迁延不愈，常由肝炎发展为肝硬化，甚至肝癌，在此过程中机体免疫反应发挥着重要作用。研究证明，乙肝慢性化的重要机制之一是HBV抗原特异性T细胞免疫耐受，患者不能产生针对HBV特异的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxJc T lymphocyte，CTL)免疫反应，所以不能清除体内病毒。造成CHB免疫耐受的重要原因之一是患者体内树突状细胞(dendritic cell，DC)缺陷，不能把病毒抗原的信号有效传递给机体免疫系统。因此，恢复DC数量或加强DC抗原递呈功能，充分激活机体免疫反应已成为治疗CHB的重要途径之一。 DC是能激活初始化T淋巴细胞的重要抗原递呈细胞，在抗病毒细胞免疫中起重要作用。通过粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)体外诱导、扩增可以获得足够的外周血单核细胞来源DC(monocyte-derived DC，MoDC)。CD1a主要表达于人胸腺细胞和DC，是人DC相对特征性标志，CD83是成熟DC的重要标记，CD80、HLA-DR是其表面重要的共刺激分子。 干扰素α(interferon-α，IFN-α)和核苷(酸)类似物是目前国内外公认的慢性乙肝抗病毒治疗药。IFN-α除直接抑制HBV复制外，通过增强机体对}tBV的免疫力也是一重要的途径，其机制较复杂；恩替卡韦(entecavir，ETV)是一新型口服核苷类药物，在细胞内经磷酸化后，与脱氧胞嘧啶核苷(dCTP)竞争进入病毒合成中的DNA链，终止病毒DNA的复制。胸腺肽α1可增强非特异性免疫功能，多用于联合治疗CHB。但这些药物对于CHB患者DC的影响，文献报道较少，尤其是ETV作为目前临床上最强的CHB抗病毒药，对于机体免疫系统的影响未见报道。本研究以IFN-α、ETV和胸腺肽α1分别与CHB的外周血MoDC体外共孵育，通过测定DC表面CD1a、CD83、CD80、HLA-DR等表型分子的表达，检测DC培养液中IL-6、IL-12含量和同种异体混合淋巴细胞反应等一系列指标观察它们对CHB的DC生物学特性的影响，为临床上应用以上药物及其与DC疫苗相结合治疗CHB寻找实验依据。 材料与方法 采集CHB患者及健康人外周新鲜静脉血以肝素抗凝后通过淋巴细胞分离液体外密度梯度离心分离获得单个核细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬单个核细胞后接种到24孔细胞培养板静置2小时，轻轻洗脱未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基(含10ng/ml rhGM-CSF和5ng/mlrhIL-4)诱导扩增，37℃、5％CO<,2>饱和湿度的细胞培养箱中培养。隔天半量换液。第5天收集DC，将CHB来源DC分别加入一定浓度的IFN-α(300U/ml)、胸腺肽α1(0.1μg/ml)和ETV(0.05μg/ml)分为IFN-α组、胸腺肽α1组、ETV组和IFN-α+胸腺肽α1组，同时设健康对照组和CHB对照组，继续共培养，第8天收获各组DC进行以下相关检测： 1.倒置显微镜下动态观察细胞形态变化。 2.流式细胞仪(FCM)测定DC表型分子CD1a、CD83、CD80及HLA-DR的表达。 3.同种异体混合淋巴细胞反应法测定DC刺激淋巴细胞增殖能力。 4.ELISA法检测DC培养上清中IL-12、IL-6含量。 结果 1.培养第8d观察各组细胞，健康对照组培养液中漂浮着较多云雾状的DC细胞团，表面突起丰富；各药物处理组均可见表面突起丰富的DC；CHB对照组DC多呈不规则形、多角形；健康对照组和各CHB药物处理组细胞分化形态优于CHB对照组。 2.培养第8d的各组DC表型分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表达，在健康对照组明显高于CHB对照组和各CHB药物处理组(P<0.05)；CHB对照组低于各CHB药物处理组(P<0.05)；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P>0.05)，但均高于ETV组(P<0.05)。 3.健康对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最强；CHB对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最弱；各CHB药物处理组强于CHB对照组；IFN-α+胸腺肽α1组、IFN-α组和胸腺肽α1组无统计学差别(P>0.05)，但均高于ETV组(.P<0.05)。 4.各组DC培养上清液中IL-12含量为健康对照组最高，其次为各CHB药物处理组，CHB对照组最低(P<0.05)；IL-6含量与之相反(P<0.05)。 结论 1.采用rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导的方法可以成功地从外周血单核细胞中体外诱导分化成DC，为进一步实验研究提供足量的细胞。 2.CHB的DC与健康人相比其分化较差，膜表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR表达降低，刺激淋巴细胞增殖能力及分泌IL-12的能力低下，提示其功能缺陷，可能是HBV慢性感染的重要原因之一。 3. IFN-α、ETV和胸腺肽α1都可以不同程度提高CHB的DC表面分子CD1a、CD83、CD80、HLA-DR的表达，促进其分泌细胞因子IL-12和增强DC刺激淋巴细胞增殖能力，提高细胞免疫的功能。 4.在促进DC功能方面，ETV较IFN-α和胸腺肽α1作用弱；IFN-α联合胸腺肽α1与单用IFN-α或胸腺肽α1差别无统计学意义。

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材料与方法

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结论

参考文献

综述树突状细胞与慢性乙型肝炎免疫治疗

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