PGC-1α通过ERRα诱导UPase的表达增强乳腺癌细胞对5'-DFUR的敏感性

摘要

目的：通过基因芯片筛选出PGc-1α的新型下游靶基因UPase，然后，研究其分子作用机理。最后，通过过表达PGC-1α研究其下游靶基因UPase的重要生物学功能。
　　 方法：为了证明PGC-1α对Upase诱导表达的机制，克隆了Upase的启动子插入到荧光启动子载体中。经过一系列的5端截短、突变，通过报告基因荧光值的变化找出PGC-1α在Upase的启动子的作用位点，然后，用软件分析Upase的启动子，找出潜在转录因子。通过报告基因基因荧光值的变化找出与PGC-1α共激活的转录因子，用EMSA进行验证实验结果。包装好PGC-1α和与其相互作用的转录因子的腺病毒，转染细胞检测UPasemRNA水平的变化。最后，在细胞水平上研究PGC-1α对Upase重要生理功能的调节。
　　 结果：
　　 1、PGC-1α和ERRs(ERRα和ERRγ)共激活UPase启动子的活性。
　　 2、将ERRE元件进行突变后，PGC-1α和ERRα共激活UPase启动子的活性受到抑制。
　　 3、XCT790(ERRα的抑制剂)抑制PGC-1α和ERRα对UPase启动子的激活作用。
　　 4、ERRα通过ERRE结合于UPase启动子。
　　 5、ERRα和PGC-1α可以共激活促进UPasemRNA的表达。
　　 6、抑制剂XCT790可以抑制ERRα介导的UPase的表达。
　　 7、ERRα和PGC-1α可以共促进UPase的表达增强乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3对5’-DFUR的敏感性。
　　 结论：发现PGc-1α共激活因子与ERR这个转录因子可相互作用来调节UPase的表达。因而可以增强口服药物5-DFUR(5-FU的前体)对癌细胞的毒害作用。通过分子机理的研究，相信会在以后的临床上会有很重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词与符号

声明

第一部分 文献综述

1.1 乳腺癌概述

1.2 基因治疗

1.3 尿苷磷酸化酶(UPase)简介

1.4 PGC-1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α)简介

1.5 雌激素相关受体(estrogen-related receptor，ERR)简介

1.6 表达系统简介

1.7 mRNA水平基因表达差异研究

1.8 本文研究的目的及意义

第二部分 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和细胞株

2.1.2 质粒载体

2.1.3 工具酶及分子量标准

2.1.4 试剂盒

2.1.5 试剂

2.1.6 实验仪器

2.1.7 分析软件

2.1.8 载体图谱

2.2 实验方法：

2.2.1 小鼠全基因组DNA的提取

2.2.2 UPase启动子各片段和ERRE位点突变报告基因质粒载体的构建

2.2.3 CaC12方法制备感受态细胞

2.2.4 小量抽提质粒

2.2.5 大量提纯质粒

2.2.6 细胞培养

2.2.7 细胞的瞬时转染

2.2.8 双荧光素酶报告系统测定启动子活性

2.2.9 腺病毒包装

2.2.10 Western Blotting

2.2.11 电泳迁移率变动分析实验(EMSA)

2.2.12 mRNA水平分析

2.2.13 MTT法

2.2.14 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.2.15 统计分析

第三部分 结果与分析

3.1 PGC-1α和ERRs(ERRα和ERRγ)共激活UPase启动子的活性

3.2 将ERRE元件进行突变后，PGC-1α和ERRα共激活UPase启动子的活性受到抑制

3.3 XCT790(ERRα的抑制剂)抑制PGC-1α和ERRα对UPase启动子的激活作用

3.4 ERRα通过ERRE结合于UPase启动子

3.5 ERRα和PGC-1α可以共激活促进UPase mRNA的表达

3.6 抑制剂XCT790可以抑制ERRα介导的UPase的表达

3.7 ERRα和PGC-1α可以共促进UPase的表达增强乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3对5’-DFUR的敏感性

讨论与展望

参考文献

致谢