AIF和Bit1在食管鳞癌中的表达及其在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用

摘要

细胞凋亡不但在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，而且在肿瘤的化疗和复发方面也扮演着重要角色，恶性肿瘤细胞抑制凋亡是促使其发生耐药、转移的关键环节。由线粒体介导的内源性凋亡通路是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径。细胞在受到诸如DNA损伤、细胞周期阻滞、失粘附和缺氧等的凋亡刺激时，可导致位于线粒体内的与凋亡相关的活性物质被释放出来介导细胞凋亡，这些活性物质有细胞色素C、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)、核酸内切酶G(EndoG)和Bitl(Bcl-2 inhibitor oftranscription)等，其中，由AIF和Bitl介导的凋亡是caspase(半胱氨酸蛋白酶)非依赖性的凋亡。 AIF是一类在进化上保守的黄素蛋白，也是一种新型的凋亡诱导蛋白，定位于线粒体内外膜间隙中，它既能诱导细胞的凋亡，也具有氧化还原酶的活性。Bitl和AIF一样定位于线粒体，在胞浆内与AES(amino-terminal enhancer ofspIit，AES)结合可介导失黏附所引发的离巢凋亡，其正常的生理功能尚不清楚。目前，仅有少量文献报道AIF和Bitl的表达与肿瘤发生发展的关系，至于AIF和Bitl与食管癌的关系国内外未见报道。 p63是p53家族新成员，由于有两个启动子，它可编码功能相反的异构体：包含转录激活结构域的TA型和缺少转录激活结构域的△N型。又由于转录后C-端的不同剪切，TA型和△N型分别有α、β和γ三种亚型。研究发现，在食管鳞癌中，p63的上调可能对鳞癌的形成起了重要作用，进一步研究发现食管鳞癌中p63的表达亚型是△Np63而不是TAp63，△Np63的高表达可能是食管鳞癌的早期事件，并对食管鳞癌的进展发挥重要的作用。TA型同源体由于在DNA结合区与p53有60％的同源性，可以结合p53同源序列并诱导p53靶基因的转录，如p21、Bax和MDM2等，在这方面，TAp63 γ同源体表现出较强的活性，可以诱导肿瘤细胞周期抑制和发生凋亡，但其诱导凋亡机制不清。因此本研究试图通过研究AIF和Bitl在食管鳞癌中的表达及其在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用，来探讨AIF和Bitl在食管鳞癌发生发展中的作用，并对TAp63抑制肿瘤的分子机制进行初步了解，同时也为将AIF和Bitl应用于肿瘤杀伤提供实验依据。 本研究拟从以下几个方面进行研究：第一，采用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织、不典型增生组织和正常食管黏膜组织中AIF和Bitl的表达；第二，利用分子生物学常规技术检测食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109细胞中AIF和Bitl的表达及p63的表达亚型；第三，采用真核细胞转染技术、细胞凋亡检测技术检测TAp63γ基因表达对EC9706细胞的周期分布及凋亡的影响；第四，利用激光共聚焦显微镜、亚细胞器分离、RNA干扰等分子生物学技术来探讨AIF和Bitl在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分食管鳞癌组织、不典型增生组织及正常食管黏膜中AIF和Bit1基因表达的研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

第二部分食管鳞癌细胞系中AIF和Bit1的表达及p63的表达亚型鉴定

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

第三部分TAp63γ基因表达对EC9706细胞的周期分布及凋亡的影响

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

第四部分AIF和Bit1在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用

前言

第一章TAp63γ诱导细胞凋亡过程中AIF和Bit1的转位研究

1材料与方法

2结果

第二章靶向型发夹状小分子RNA表达载体的构建与鉴定

1材料与方法

2结果

第三章下调AIF和Bit1的蛋白表达水平对TAp63γ诱导细胞凋亡的影响

1材料与方法

2结果

第四部分讨论

第四部分小结

全文结论

参考文献

综述（一） 食管鳞癌癌变的组织学模式及分子机理

综述（二） p63基因的研究概况

附录

致谢