硫酸软骨素化学发光法的快速测定及其ELISA双抗体夹心法的建立

摘要

肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,近十年来,肺癌的研究虽已取得了不少成绩,但迄今为止肺癌对人类健康仍然有很大威胁.在我国肺癌发生率与病死率也有明显升高的趋势.据统计,约有70﹪的肺癌患者在发现时已属中、晚期,失去了手术的最佳时机,如能早期发现可以使患者的5年生存率明显提高.随着生命科学研究的不断发展,人们发现癌细胞能分泌一些活性物质,通过现代实验技术手段能够检测出来,这些活性物质被称为肿瘤标志物.肿瘤标志物对肿瘤的早期发现,检测肿瘤的发生生长、侵袭、转移、判断疗效及预后等方面均有重要的意义. 目前应用较多的肺癌相关肿瘤标志物有神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、组织多肽抗原(TPA)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)等,但由于灵敏度和特异性较低,临床应用受到制约.所以,长期以来,人们一直致力于寻找灵敏度和特异性都较高的肺癌肿瘤标志物,硫酸粘多糖是近些年来研究较多的一种肺癌肿瘤标志物.许多研究表明硫酸粘多糖在非小细胞肺癌中有较高的阳性率(86.20﹪),而且特异性和敏感性都较高(特异性为96.55﹪,敏感性为86.20﹪),提示硫酸粘多糖可能是协助肺癌诊断的一个很好的标志物.硫酸粘多糖的正确命名是糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG),它是由糖醛酸与乙酰氨基糖或其硫酸酯组成的二糖单位形成的重复序列.哺乳动物的GAG包括硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮肤素(Dermatan sulfate,DS)、硫酸角质素(Karatansulfate,KS)、肝素(Haparin,HP)、硫酸肝素或硫酸乙酰肝素(Haparan,HS)及透明质酸(Hyaluronic acid,HA)6种.研究发现,硫酸粘多糖在肺癌早期即有升高,无论原发还是转移性肺癌,癌组织中均有GAG含量增高,主要以透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)的升高为主. 目前国内外相关报道的检测硫酸软骨素的方法很多,如比色法、色谱法、电泳法、配位滴定法、原子吸收法等.但这些方法都有其自身的局限性,主要是灵敏度低,本课题希望建立一种快速、灵敏、准确的检测硫酸软骨素的方法,为下一步建立检测硫酸粘多糖的方法奠定基础.方法和结果: 1.采用Ced<'4+>-Na<,2>SO<,3>-H<,2>SO<,4>氧化还原体系,并利用该体系中加入硫酸软骨素后发光强度明显增强的特点,建立了一种快速测定硫酸软骨素的化学发光分析方法.检测结果如下:回归方程为y=0.4219x+3.3532,r=0.9968(其中y为样品RLU与空白RLU的差值,x为CS浓度),线性范围为1.Omg/L8.0m/L,检出限为0/5mg/L.本部分初步建立了硫酸软骨素的化学发光检测方法,为以后的研究奠定基础. 2.为了制备多克隆抗体,用硫酸软骨素作为免疫原分别免疫了4只BALB/c小鼠和2只日本大耳白兔.制备的抗血清分别用间接ELISA测效价和特异性,结果如下:4只BALB/cdJ、鼠抗血清终点效价分别为:1:6400,1:12800,1:6400,1:3200,特异性良好;2只日本大耳白兔抗血清终点效价分别为1:64000,1:128000,且特异性良好. 3.通过优化条件,初步建立了硫酸软骨素的异种动物双抗体夹心ELISA检测方法.选取的检测优化条件为:包被抗体是1:200的2号鼠抗血清,封闭液是1﹪酪蛋白,第二抗体是1:20000的2号兔抗血清,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgC(HRP-IgG)浓度是1:4000.检测结果如下:回归方程为y=0.2945x+0.3968..r=0.9819(其中y为阳性孔OD值和阴性孔OD值之差,x为ln[CS]),线性范围是2～800 mg/L,且该方法的特异性良好.高、中、低3个浓度的批内和批间相对标准偏差的平均值分别为4.48﹪和5.97﹪. 4.用间苯三酚分光光度法检测硫酸软骨素标准品,结果如下:回归方程为y=0.0011x-0.0106,(y是吸光度,x是CS的浓度),相关系数r=0.9918,线性范围为200～800 mg/L.以间苯三酚分光光度法为标准参比方法验证异种动物双抗体夹心ELISA方法的可靠性,检测结果进行相关性和配对t检验分析,t=-0.247,P>0.05,r=0.999,P<0.01,表明2种方法相关性良好,ELISA检测结果可靠.结论:1.建立了快速测定硫酸软骨素的化学发光法,回归方程为y=0.4219x+3.3532,r=0.9968(其中y为样品RLU与空白RLU的差值,x为CS浓度),线性范围为:1.0 mg/L～8.0 mg/L,方法的检出限为O.5 mg/L.2.初步建立了硫酸软骨素的异种动物双抗体夹心ELISA检测方法,回归方程为y=0.2945x+0.3968,r_=0.9819(其中y为阳性孔OD值和阴性孔OD值之差,x为In[CS]),线性范围是2mg/L～800mg/L,且方法的特异性良好,检测结果可靠.

目录

文摘

英文文摘

引言

第1部分 化学发光法快速测定硫酸软骨素

1仪器与试剂

2方法与结果

3讨论

第2部分 硫酸软骨素ELISA检测方法的建立

1前言

2硫酸软骨素多克隆抗体的制备和性质鉴定

2.1材料

2.2方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5小结

3硫酸软骨素异种动物双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

4方法学比较

4.1材料

4.2方法和结果

4.3小结

5小结

结论及展望

参考文献

肺癌肿瘤标志物研究进展

缩略词表

致谢