MK反义寡核苷酸对宫颈鳞癌Hela229细胞中MK表达影响的研究

摘要

背景和目的：宫颈癌是全世界也是我国最常见的恶性肿瘤之一,在女性生殖系统恶性肿瘤中其发生率位居第一,且逐年趋向年轻化。宫颈癌的病因及发生机制目前尚不十分明了,但许多研究证明其发生、发展和浸润、转移是较多复杂的因素、多个阶段、多基因共同参与的非常复杂的过程。所以,如何寻求与宫颈癌发生、发展相关的特异性的指标已成为研究人员的研究热点之一。中期因子(midkine,MK)是Kadomatsu等采用差异杂交的方法在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM-1细胞cDNA文库中筛选出的一种新基因。最初研究发现其可促进神经细胞突起生长、神经干细胞分化和胚胎神经元的存活等。之后研究发现在生理情况下MK基因的表达随个体的发育而变化,在胚胎期高表达,出生后逐渐降低,在成年肾脏和小肠上皮组织之外的其他部位几乎不表达。而在疾病情况下,特别是恶性肿瘤组织中MK mRNA出现高强度、高频率表达。其可能与肿瘤的发生、生长及转移有关。研究表明MK在胃癌、食管癌、胰腺癌、骨肉瘤、子宫内膜癌以及神经系统肿瘤等组织中过表达。有关MK在宫颈癌组织中的表达情况以及其与宫颈癌发生、发展关系的研究少有文献报道。为进一步探讨MK表达与宫颈癌发生、发展的关系;寻找抑制宫颈癌发生、发展及浸润转移的有效方法,本文采用免疫组织化学、原位杂交技术检测60例宫颈鳞癌组织、29例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织及48例正常宫颈组织中MK蛋白及mRNA表达;MK反义寡核苷酸经阳离子脂质体介导转染宫颈鳞癌Hela229细胞后,运用免疫细胞化学、原位杂交方法检测转染后Hela229细胞中MK蛋白及mRNA表达情况。为运用MK反义寡核苷酸达到靶向治疗宫颈癌等恶性肿瘤提供理论依据。
　　材料和方法：1.材料60例宫颈鳞癌组织、29例CIN组织及48例正常宫颈组织为平煤集团公司总医院及郑州大学三附院2004年3月至2008年12月间手术切除标本;人宫颈鳞癌Hela229细胞由中科院上海细胞生物学研究所提供。2.方法(1)采用免疫组织化学、原位杂交技术检测宫颈鳞癌组织、CIN组织及正常宫颈组织中MK蛋白及mRNA表达;(2)设计合成2条MK反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2)及1条无关序列寡核苷酸(N-ODN);(3)分别采用150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml3种不同浓度的MK ASODN1、ASODN2和N-ODN体外分组转染培养的Hela229细胞48h和72h。另设细胞空白对照(不进行任何操作);(4)采用免疫细胞化学方法及完整细胞原位杂交方法观察MK ASODN对Hela229细胞中MK蛋白和mRNA表达的影响。(5)运用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。阳性率之间的比较采用x2检验;计量资料以均数±标准差((?)±S)表示,两组均数的比较运用两样本t检验(t-test);两组以上均数比较采用方差分析(ANVOA);以α=0.05为检验水准。
　　结果：1.MK蛋白及mRNA的表达:MK蛋白及mRNA在宫颈鳞癌组织、CIN组织中存在表达,而在正常宫颈组织中未见表达。蛋白阳性染色位于宫颈鳞癌组织及CIN组织细胞膜和(或)细胞质中,呈棕黄色颗粒;MK mRNA定位于宫颈鳞癌组织及CIN组织细胞质内,呈蓝紫色颗粒。2.免疫组织化学结果:正常宫颈上皮组织、CIN组织及宫颈鳞癌组织中MK的蛋白阳性表达率分别为0.00％(0/48)、20.69％(6/29)和65.00％(39/60)。x2检验结果,x2=53.543,P<0.01。经x2分割组间差异均有统计学意义(P<0.05)。3.原位杂交结果:MK mRNA在正常宫颈上皮组织阴性表达0.00％(0/48),在CIN组织及宫颈鳞癌组织中MK mRNA阳性表达率分别为31.03％(8/29)和71.67％(43/60)。x2检验结果,x2=60.073,P<0.01。x2分割组间差异均有统计学意义(P<0.05)。4.MK ASODN对宫颈鳞癌Hela229细胞中MK蛋白表达的影响:Hela229细胞中存在MK蛋白表达,位于Hela229细胞质中,呈棕黄色颗粒。3种不同浓度的MK ASODN1、ASODN2对Hela229细胞中MK蛋白表达均有显著的抑制作用,且以250μg/ml ASODN1的抑制效应最强(P<0.05),72h的作用效应较48h强(P<0.05);但不同浓度间、不同ASODN间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。N-ODN转染组和对照组与ASODN1、ASODN2经方差分析,P<0.05,各实验组均数两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。5.MK ASODN对宫颈鳞癌Hela229细胞中MK mRNA表达的影响:Hela229细胞中存在MK mRNA表达,位于Hela229细胞质中,呈蓝紫色颗粒。3种不同浓度的MK ASODN1、ASODN2对Hela229细胞中MK mRNA表达亦均有显著的抑制作用,250μg/ml ASODN1的抑制效应最强(P<0.05),72h的作用效应强于48h(P<0.05);但不同浓度间、不同ASODN间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。N-ODN转染组和对照组与ASODN1、ASODN2经方差分析,P<0.05,各实验组均数两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。
　　结论：1.MK蛋白及mRNA表达与宫颈鳞癌的发生、发展有关。2.Hela229细胞中存在MK蛋白及mRNA表达。表明MK可作为宫颈癌等恶性肿瘤有效的基因治疗靶点。3.MK ASODN对Hela229细胞中MK蛋白和mRNA表达具有显著的抑制作用,该研究结果为运用MK ASODN达到靶向治疗宫颈癌等恶性肿瘤提供理论依据。

目录

摘要

Abstract

论文部分 MK反义寡核苷酸对宫颈鳞癌Hela229细胞中MK表达影响的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述部分 MK(中期因子)与肿瘤关系的研究进展

参考文献

中英文缩写词

致谢