中药对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的抑制作用

摘要

中药药动学研究是中药走向现代化之路的重要途径,但这一直是中药现代化的瓶颈之一,大多数中药在体内的代谢尚不清楚,致使其临床应用缺乏科学依据,从而影响疗效或引起不良反应。药物不良反应多由药物相互作用引起,而代谢性相互作用的发生率最高。药物代谢主要依赖于肝脏中的细胞色素P450混合功能氧化酶系(cytochromeP450,CYP450)。CYP介导的药物相互作用主要为酶诱导和酶抑制,酶抑制是引起药物相互作用的重要原因。近年来,有关中药引起的药物相互作用逐渐受到重视。临床上中药的主要应用形式是复方制剂。当多种药物联合应用时,就很容易出现不良反应。由于中药组成的复杂性,由中药引起的相互作用机制尚不清楚。因此,研究中药对CYP450的影响就显得非常具有实际意义。
　　目的：本论文拟采用体外实验,研究灯盏细辛注射液等37种中药及其主要有效成分对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的影响,初步筛选出对这三种酶有抑制作用的中药;采用动物体内实验进一步确证香丹注射液、血塞通注射液和银黄口服液对大鼠CYP2C19的抑制作用,从而为确定细胞色素P450酶(CYP450)在中药代谢中的作用,阐明中药对大鼠CYP450的作用,丰富中医基础理论、预测药物相互作用和中药的安全性评价以及指导临床合理用药提供依据。
　　方法：1.体外筛选对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中药1.1大鼠肝微粒体制备取肝脏采用钙沉淀法制备肝微粒体。1.2肝微粒体蛋白含量测定Bradford法测定肝微粒体蛋白含量。1.3孵育反应实验分实验组和对照组,实验组中加入中药,对照组加入等体积的磷酸盐缓冲液。孵育体系总体积CYP2D6为500μl,CYP1A2和CYP2C19为200μl。反应体系中包含NADPH,磷酸盐缓冲液,EDTA,MgCl2,微粒体蛋白和相应的探针药物(分别是氢溴酸右美沙芬,非那西丁,奥美拉唑)。1.4酶活性测定以探针药物的转化程度作为酶活性的指标。1.5探针药物方法学考察建立测定大鼠肝微粒体中氢溴酸右美沙芬、非那西丁和奥美拉唑的HPLC法,并按生物样品的测定要求,对方法的专属性、灵敏度、精密度、稳定性、回收率和线性范围等进行考察。1.6肝微粒体蛋白浓度和孵育时间对探针药物代谢的影响分别设定不同的肝微粒体蛋白浓度和孵育时间,考察与探针药物代谢的关系,确定最佳蛋白浓度和孵育时间。分别确定0.75mg·ml-1、0.75mg·ml-1、0.20mg·ml-1和40min、30min、20min作为CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19孵育体系的肝微粒体蛋白浓度和孵育时间。2.血塞通注射液、香丹注射液和银黄口服液对大鼠CYP2C19的抑制作用2.1给药方案按照随机对照原则,血塞通注射液、香丹注射液、银黄口服液分别设立实验组和对照组,每组10只雄性SD大鼠,实验组分别给予血塞通注射液(4.17ml·kg-1)、香丹注射液(10.42ml·kg-1)、银黄口服液(31.25ml·kg-1),对照组分别给予相应等体积的生理盐水。连续给药7天。2.2肝微粒体制备及蛋白含量测定末次给药后24小时断头处死大鼠,取肝脏采用钙沉淀法制备肝微粒体,Bradford法测定肝微粒体蛋白含量。2.3孵育反应孵育体系包含NADPH,磷酸盐缓冲液,EDTA,MgCl2,微粒体蛋白和奥美拉唑。2.4色谱条件色谱柱5μm DiamonsiL C18柱(4.6mm×200mm),流动相为甲醇:乙腈:0.1mol·L-1乙酸铵溶液=10:35:55,流速1.0ml·min-1,检测波长302nm,柱温25℃,进样量30μl。2.5酶活性测定采用高效液相色谱法(HPLC)测定奥美拉唑的浓度,以奥美拉唑的转化程度(TR)作为酶活性的指标。3.统计分析运用SPSS10.0统计软件进行数据分析,所有数据均以平均值±标准差((A)±S)表示,采用独立样本t检验分析两组间酶的活性差异。a=0.05作为检验水准。
　　结果：1.体外筛选对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中药1.1探针药物方法学考察肝微粒体样品中杂质不干扰氢溴酸右美沙芬、非那西丁、奥美拉唑的测定,日内和日间变异系数均小于15％,肝微粒体中探针药物的线性范围分别为5.0~160.0μmol·L-1、6.25~200.0μmol·L-1、1.0~32.0μmol·L-1,标准曲线的相关系数分别为0.9994、0.9996、0.9998;样品处理简单快速,方法的灵敏度、重现性、稳定性和精密度均达到生物样品的分析要求。1.2对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中药通过体外实验,从37种中药中筛选出血塞通注射液、清开灵注射液、银黄口服液、蓝芩口服液4种中药对CYP2D6酶的活性有显著抑制作用(P<0.05);清开灵注射液、茵栀黄注射液、穿心莲注射液3种中药对CYP1A2酶的活性有显著抑制作用(P<0.05);茵栀黄注射液、香丹注射液、双黄连注射液、穿心莲注射液、血塞通注射液、银黄口服液6种中药对CYP2C19酶的活性有显著抑制作用(P<0.05)。1.3中药对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的IC50血塞通注射液、清开灵注射液、银黄口服液、蓝芩口服液对CYP2D6酶的IC50分别为0.99ml·100ml-1、0.65ml·100ml-1、0.15ml·100ml-1、0.14ml·100ml-1;清开灵注射液、茵栀黄注射液、穿心莲注射液对CYP1A2酶的IC50分别为3.55ml·100ml-1、2.43ml·100ml-1、2.49ml·100ml-1;茵栀黄注射液、香丹注射液、双黄连注射液、穿心莲注射液、血塞通注射液、银黄口服液对CYP2C19酶的IC50分别为0.67ml·100ml-1、0.64ml·100ml-1、0.90ml·100ml-1、0.81ml·100ml-1、0.75ml·100ml-1、0.056ml·100ml-1。上述中药对CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19酶的抑制作用呈浓度依赖性。1.4中药与其有效成分的比较清开灵注射液与其主要有效成分(黄芩苷+栀子苷)对CYP2D6的抑制作用无显著差别(P>0.05)。银黄口服液和蓝芩口服液对大鼠CYP2D6的抑制作用显著强于其相应主要有效成分(分别为黄芩苷和栀子苷)(P<0.05);茵栀黄注射液、清开灵注射液、穿心莲注射液与其相应有效成分(分别为黄芩苷+栀子苷、黄芩苷+栀子苷、穿心莲内酯)对大鼠CYP1A2的抑制作用和茵栀黄注射液、双黄连注射液、银黄口服液、血塞通注射液与其相应有效成分(分别为黄芩苷+栀子苷、黄芩苷、黄芩苷、三七总皂苷)对大鼠CYP2C19的抑制作用均无显著差别(P>0.05)。2.血塞通注射液、香丹注射液和银黄口服液对大鼠CYP2C19的抑制作用静脉注射血塞通注射液对大鼠CYP2C19有显著抑制作用(P<0.01),静脉注射香丹注射液和灌胃给予银黄口服液对大鼠CYP2C19均无显著抑制作用(P>0.05)。
　　结论:1.血塞通注射液、清开灵注射液、银黄口服液、蓝芩口服液体外对大鼠CYP2D6酶活性有显著抑制作用;清开灵注射液、茵栀黄注射液、穿心莲注射液体外对大鼠CYP1A2酶活性有显著抑制作用;茵栀黄注射液、血塞通注射液、香丹注射液、双黄连注射液、银黄口服液、穿心莲注射液在体外对大鼠CYP2C19酶活性有显著抑制作用,且上述中药对CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的抑制作用呈浓度依赖关系。2.清开灵注射液等中药与其相应有效成分对大鼠CYP450酶的抑制作用有的有显著差别,有的无显著差别。3.在大鼠体内,血塞通注射液对大鼠CYP2C19有显著抑制作用,香丹注射液和银黄口服液对大鼠CYP2C19无显著抑制作用。

目录

摘要

Abstract

论文部分 中药对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19的抑制作用

前言

第一部分 体外筛选对大鼠CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19有抑制作用的中药

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

第二部分 血塞通注射液、香丹注射液、银黄口服液对大鼠CYP2C19的抑制作用研究

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

全文小结

参考文献

综述

中药对CYP1A2 CYP2D6和CYP2C19影响的研究进展

参考文献

中英文对照缩略词表

致谢