猎圆环病毒2型ELISA抗体检测方法的建立及PCV2单克隆抗体的制备

摘要

猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)是由猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type2,PCV2)引起的一种猪的重要传染性疾病。PMWS最早于1991年在加拿大西部被发现,之后便在全世界范围内流行。该病主要侵害断奶仔猪,临床表现为仔猪发热、进行性消瘦、苍白、黄疸、呼吸衰竭及消化系统功能紊乱等症状。
　　 猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,属DNA病毒。分为1型(PCV1)和2型(PCV2)。
　　 PCV1是细胞污染物,无致病性；PCV2有致病性,PCV2的感染可以造成免疫抑制,引起猪相关疾病的继发和并发感染,如增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、以及猪呼吸道综合征(PRDC)、先天性震颤、肠炎、繁殖障碍等。目前,PCV2成为世界范围内对养猪业危害最严重的病原之一。
　　 PCV2基因组包含11个开放阅读框,其中ORF1和ORF2是主要的阅读框。ORF1编码Rep蛋白,与病毒复制相关,此蛋白在这两型病毒之间有85％同源性,是引起PCV1和PCV2抗原交叉反应的主要因为。ORF2编码的Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,是型特异性抗原,具有良好的免疫原性,在两型PCV之间不发生抗原交叉反应。
　　 本研究建立了PCV2抗体间接ELISA检测方法。这种方法的特点是敏感、快速、特异,并能够有效鉴别2型PCV的感染,对PCV2快速诊断、流行监测和防控具有重大的意义。
　　 1.克隆了PCV2 ORF2基因片段,在大肠杆菌原核表达系统中表达ORF2基因片段。结果表明,该基因片段在BL21中成功表达,融合蛋白的相对分子质量约为26kDa,并能为PCV2阳性血清所识别。
　　 2.以表达的Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV2 Cap蛋白间接ELISA检测方法；利用建立的间接ELISA方法对猪场的80份血清进行检测,并与商品化的试剂盒进行了对照,检出阳性率为60％,两种方法符合率为93％。
　　 3.利用PCV2河南株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,通过建立的间接ELISA方法检测筛选,最终获得2株稳定分泌抗PCV2单克隆抗体的细胞株:2811-C1、3F2-A10。特异性实验表明:2811-C1、3F2-A10不与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及正常PK-15细胞反应,特异性良好。两株PCV2单抗的获得,为进一步建立特异、敏感、准确快速的PCV2检测方法打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 文献综述

1 病原学

1.1 猪圆环病毒的发现与命名

1.2 PCV的分类地位及分型

1.3 PCV的形态及理化特征

1.4 PCV的增殖与培养特性

2 PCV的分子生物学特性

2.1 PCV的基因组特征

2.2 PCV编码蛋白及功能

2.3 PCV的复制及转录

3 流行病学

4 致病机理

5 PCV2检测方法研究进展

5.1 电镜法

5.2 免疫组织化学检测技术(IHC)

5.3 免疫荧光技术

5.4 酶联免疫吸附试验诊断方法

5.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验

5.6 免疫胶体金技术

5.7 聚合酶链反应

5.8 原位杂交方法

5.9 基因芯片检测技术

6 PCV2感染的防治

7 猪圆环病毒单克隆抗体研究进展

7.1 单克隆抗体技术

7.2 PCV2单克隆抗体的研究

8 本研究的意义

第二部分 猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达

1 材料与试剂

1.1 病毒、载体及菌株

1.2 主要试剂和酶

1.3 主要试剂配制

2 方法

2.1 引物设计与合成

2.2 PCR模板的制备

2.3 PCR扩增

2.4 DNA片段回收

2.5 重组质粒pMD18-T-ORF2的构建

2.6 重组原核表达质粒的构建

2.7 重组融合蛋白PET-28a-ORF2的诱导表达及检测

3 结果与分析

3.1 目的基因片段的扩增

3.2 pMD18-T-ORF2的酶切鉴定

3.3 重组质粒pET-28a-ORF2的PCR和酶切鉴定

3.4 重组蛋白的SDS-PAGE分析

3.5 重组蛋白的Western-Blot分析

4 讨论

第三部分 PCV2 Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立

1 材料与试剂

1.1 主要实验仪器和设备

1.2 主要试剂配制

2 方法

2.1 包涵体的制备和纯化

2.2 包涵体的复性

2.3 间接ELISA检测方法的建立

3 结果与分析

3.1 重组蛋白抗原最佳包被浓度与血清稀释度的确定

3.2 重组抗原包被条件的确定

3.3 封闭液的选择

3.4 一抗血清最佳反应时间的确定

3.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定

3.6 酶标二抗最佳工作时间的确定

3.7 显色时间的确定

3.8 间接ELISA阴阳性临界值的确定

3.9 特异性试验

3.10 重复性试验

3.11 临床血清样品检测

4 讨论

第四部分 PCV2单克隆抗体的制备

1 材料与试剂

1.1 病毒、实验动物与细胞

1.2 主要试剂配制

2 方法

2.1 免疫原的制备

2.2 免疫

2.3 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

2.4 杂交瘤细胞株的建立

2.5 单克隆抗体的生产

2.6 杂交瘤细胞株的鉴定

3 结果

3.1 PCV2的PCR检测

3.2 PCV2抗原的含量

3.3 免疫结果

3.4 ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3.5 细胞融合筛选结果

3.6 杂交瘤细胞培养上清效价的测定

4 讨论

4.1 病毒培养

4.2 抗原制备

4.3 动物免疫

4.4 细胞融合

4.5 关于细胞培养中的问题

第五部分 全文总结

参考文献

硕士期间发表的学术论文与研究成果

致谢