桔梗多糖的提取、分离纯化和结构研究

摘要

桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.)作为一种药食两用的中药材,在我国种植面积广阔。药理研究显示桔梗多糖具有很好的抗肿瘤和增强机体免疫活性的作用,因此桔梗多糖(PGP)有很好的研究价值。本文以桔梗为模型,对桔梗多糖的含量测定、提取工艺、分离纯化、纯度鉴定及结构分析等方面进行了较系统的研究。现将研究方法与结论分述如下:
　　 1、采用间接法测定桔梗多糖的含量。运用蒽酮-硫酸法测定桔梗总糖(包括多糖和还原性的单糖)的含量,分别采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)、间接碘量法、菲林滴定法测定还原糖的含量。总糖含量与还原糖含量之差即为多糖的含量。三种方法测得的桔梗多糖的含量分别为95.55％、96.01％、95.75％。结果显示三种方法测得的值相近,但是综合实验成本、设备、操作及影响测定的因素等多方面考虑,选用蒽酮-硫酸法与DNS法相结合测定桔梗多糖的含量。
　　 2、采用传统的水煮醇沉法提取桔梗多糖,分别考察了提取温度、提取时间、料液比、提取次数对桔梗多糖提取率的影响,在单因素实验的基础上采用了四因素三水平正交试验来优化桔梗多糖的提取工艺。正交试验结果表明,桔梗多糖提取的最佳工艺条件为:提取温度为80℃,提取时间为2h,提取次数为2次,料液比为1:25。通过3次平行验证实验得出在该方案下桔梗多糖的提取率为42.51％。
　　 3、采用Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3种方法分别对桔梗多糖进行脱蛋白研究,以蛋白脱除率和多糖损失率为衡量指标,结果显示Sevag法除蛋白效果较好,其工艺条件为:多糖:氯仿:正丁醇=25:5:1,剧烈振摇20min。脱色方法采用H2O2氧化法,脱色条件为:多糖液:H2O2=4:1,以浓氨水或0.1％NaOH调pH值为8.8,37℃保温12h。采用Sephadex G-25柱层析法脱盐及小分子物质。
　　 4、纯化后的桔梗多糖采用DEAE-纤维素52进行分离主要得到三种组分:PGPN、PGPA1、PGPA3。三种组分经过Sephadex G-100柱层析进一步分离后均得到单一对称的洗脱峰。利用Sephadex G-100柱层析、旋光度测定法、紫外分光光度法对三种多糖进行纯度鉴定得出三种多糖都为均一的多糖,且都不含蛋白质和核酸。利用Sephadex G-200柱层析测得三种多糖的分子量分别为10233、4677、23442。
　　 5、采用薄层色谱法(TLC)对桔梗多糖的单糖组成进行了分析,TLC图谱显示PGPN的单糖组成中含有果糖,还含有葡萄糖和半乳糖中的一种或者两种皆有；PGPA1是由半乳糖和果糖组成的;PGPA3是由半乳糖和木糖组成的。IR光谱显示PGPN的单糖是由呋喃糖和吡喃糖共同组成的；PGPA1的单糖也是由呋喃糖和吡喃糖共同组成的；PGPA3的单糖是由吡喃糖组成的,糖苷键类型为α-型,可能含有β-型糖苷键。1H-NMR图谱显示PGPN的糖苷键类型均为α-型,PGPA1糖苷键类型均为β-型；PGPA3的糖苷键类型既有α型也有β型。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 多糖的生物活性研究概述

1.1.1 抗肿瘤作用

1.1.2 免疫增强作用

1.1.3 抗感染、抗病毒作用

1.1.4 抗氧化作用

1.1.5 降血糖、降血脂作用

1.1.6 抗炎症效应

1.1.7 抗凝血作用

1.1.8 抗辐射作用

1.1.9 抗溃疡作用

1.2 多糖的提取、分离纯化和结构研究概述

1.2.1 多糖的提取

1.2.2 多糖的含量测定

1.2.3 多糖的纯化

1.2.4 多糖的分离

1.2.5 多糖的纯度鉴定

1.2.6 多糖的结构分析

1.3 桔梗的研究现状

1.3.1 桔梗的化学成分

1.3.2 桔梗的药理作用

1.4 本课题的立题背景、研究意义及研究内容

1.4.1 立题背景及研究意义

1.4.2 主要研究内容

1.4.3 本论文的创新点

第二章 桔梗多糖的提取及含量测定方法的研究

2.1 实验材料

2.1.1 原料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 桔梗多糖的提取

2.2.2 总糖含量测定

2.2.3 还原糖含量测定

2.3 实验结果

2.3.1 总糖含量测定结果

2.3.2 还原糖含量测定结果

2.3.3 多糖的含量测定结果

2.4 讨论

2.4.1 原料预处理

2.4.2 提取方法

2.4.3 比色法

2.4.4 间接碘量法

2.4.5 菲林滴定法

2.5 本章小结

第三章 桔梗多糖提取工艺的优化研究

3.1 实验材料

3.1.1 原料

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 桔梗多糖提取工艺

3.2.2 桔梗多糖提取的单因素实验

3.2.3 桔梗多糖提取的正交试验

3.3 实验结果与分析

3.3.1 单因素实验结果

3.3.2 桔梗多糖提取的正交试验结果

3.3.3 正交试验结果验证

3.4 本章小结

第四章 桔梗多糖的分离纯化研究

4.1 实验材料

4.1.1 原料

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验试剂

4.2 实验方法

4.2.1 纯化工艺流程

4.2.2 除蛋白方法的研究

4.2.3 脱色方法的研究

4.2.4 脱盐

4.2.5 DEAE-纤维素52柱层析分离桔梗多糖

4.2.6 Sephadex G-100柱层析纯化桔梗多糖

4.2.7 桔梗多糖的纯度鉴定

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 蛋白质含量测定标准曲线

4.3.2 三种除蛋白方法的结果

4.3.3 三种除蛋白方法的结果比较

4.3.4 脱色

4.3.5 脱盐

4.3.6 DEAE-纤维素52柱层析结果

4.3.7 Sephadex G-100柱层析结果

4.3.8 纯度鉴定的结果

4.4 本章小结

第五章 桔梗多糖的结构研究

5.1 实验材料

5.1.1 材料

5.1.2 实验仪器

5.1.3 实验试剂

5.2 实验方法

5.2.1 桔梗多糖的分子量测定

5.2.2 桔梗多糖的水解

5.2.3 薄层层析(TLC)分析桔梗多糖的单糖组成

5.2.4 桔梗多糖的红外光谱测定

5.2.5 桔梗多糖的NMR测定

5.3 实验结果

5.3.1 分子量测定结果

5.3.2 桔梗多糖的薄层层析结果与分析

5.3.3 桔梗多糖的红外光谱结果与分析

5.3.4 桔梗多糖的NMR光谱结果与分析

5.4 讨论

5.4.1 桔梗多糖的分子量测定

5.4.2 桔梗多糖的结构研究

5.5 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 全文总结

6.2 论文中存在的问题

6.3 展望

参考文献

致谢

个人简历