DFO、DFO联合AS2O3对HL-60细胞移植瘤裸鼠的治疗作用及对NF-κBP65表达影响

摘要

研究目的
　　 采用铁螯合剂去铁胺(DFO)、去铁胺联合三氧化二砷(AS2O3)对高致瘤性HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠进行治疗，观察上述药物对移植瘤裸鼠的治疗作用及对移植瘤组织NF-к Bp65表达水平的影响，探讨其作用机制，为临床采用铁螯合剂治疗或辅助治疗白血病提供实验依据。
　　 研究方法
　　 1.采用皮下接种的方法，构建高致瘤性HL-60白血病细胞裸鼠移植瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为4组：50mg/kg DFO单药组、联合用药组(50mg/kg DFO+1.5mg/kg As2O3)、3 mg/kg As2O3单药组、生理盐水对照组；于接种的当天开始给药，连续给药10天，全部采用腹腔注射，实验协议通过郑州大学第一临床学院伦理委员会批准。
　　 2.给药期间密切观察裸鼠的一般状况，裸鼠接种后的成瘤时间及移植瘤的生长特点，同时观察荷瘤裸鼠对药物的不良反应。用游标卡尺每天测量移植瘤块的最大长径(a)和短径(b)，依据公式：体积=ab2/2，计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
　　 3.荷瘤裸鼠在全部用药结束后24小时处死，计算移植瘤的瘤重量、抑瘤率。
　　 4.荷瘤裸鼠在处死后，取其移植瘤组织做常规病理学检查，观察移植瘤组织的形态学改变；取荷瘤裸鼠骨髓，观察有无骨髓抑制和白血病细胞浸润；取荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾组织，观察有无病理改变及瘤转移。
　　 5.采用免疫组织化学即用型二步法(非生物素)检测各组移植瘤组织NF-к Bp65的表达水平变化，运用专业图像分析系统Biosens Digital ImagingSystem(v1.6)进行积分光密度测定，用阳性区平均积分光密度值来表示NF-к Bp65免疫组化染色阳性的表达程度。
　　 6.统计分析：采用SPSS16.0 for Windows软件包进行统计学处理；样本数据采用均数±标准差(X±S)表示；治疗组与生理盐水对照组的移植瘤重量比较采用t检验，4组移植瘤组织免疫组化NF-к Bp65表达水平比较采用单因素方差分析；统计检验均为双侧概率检验(α=0.05)，P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.裸鼠接种后的成瘤情况及移植瘤的生长特点：用体外培养的高致瘤性HL-60细胞(约1×106个细胞/只)接种，于接种后第7～8天30只裸鼠全部成瘤，出现肉眼可见的瘤块，直径约0.5cm～1.0cm大小，成瘤率为100％。移植瘤生长早期仅在裸鼠接种局部皮下生长，生长迅速，呈向外膨胀性生长的特性，表现为圆形或椭圆形，随着瘤体增长逐渐成为不规则形，表面呈多个结节融合状。从外部观察这些移植瘤边界较清楚，肿瘤与皮肤无粘连，活动度可，似有包膜，表皮血管丰富，但随着移植瘤体积进行性增大，肿瘤活动度逐渐下降。当移植瘤直径长至2.0cm及其以上时，在移植瘤表皮中央出现褐色的边缘不规则的坏死灶，坏死面积随着时间延长持续扩大。该移植瘤组织较易剥离，离体后可见瘤组织有一层完整的包膜、包膜上血供丰富、切面似鱼肉状、组织松脆易碎。
　　 2.给药期间裸鼠的一般状况：给药第1天至给药第7天各组荷瘤裸鼠精神状态均良好，活动正常，反应敏捷，进食、进水正常，皮肤颜色如常，大便正常，未见明显异常反应。从给药第8天开始，随着移植瘤体积的增大，荷瘤裸鼠正常活动逐渐受到影响，行动较前迟缓，进食、进水减少。当移植瘤直径长至2.0cm及其以上时，荷瘤裸鼠逐渐呈现恶病质状态，肤色逐渐由粉色转为淡青色，且随着移植瘤的增大体重逐渐增长。给药期间，观察到As2O3单药组有2只裸鼠出现腹水，对照组有1只裸鼠出现眼部转移瘤，除此之外，各治疗组荷瘤裸鼠一般状况与对照组相比无明显差异。
　　 3.不同用药组移植瘤体积增长情况：随着时间的延长，荷瘤裸鼠移植瘤体积越来越大。各治疗组移植瘤体积增长速度均较对照组慢，其中以DFO联合As2O3组移植瘤体积增长最慢，其次为As2O3单药组和DFO单药组。给药第1天至给药第5天，所有裸鼠无移植瘤生长，从给药第6天开始，各治疗组的移植瘤平均体积均小于生理盐水对照组，且随着给药时间的延长，各治疗组与对照组移植瘤平均体积的差值进一步扩大。到第11天时，生理盐水对照组移植瘤平均体积最大，其次是DFO单药组，再次是As2O3单药组，而DFO联合As2O3用药组的移植瘤平均体积最小，说明不同用药组对高致瘤HL-60白血病细胞裸鼠异种移植瘤体积随时间变化的趋势有影响。
　　 4.DFO单药组和As2O3单药组对高致瘤性HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的抑瘤率分别为2.56％和10.67％，移植瘤重量分别为(2.55±0.82)g和(2.34±0.79)g，与生理盐水对照组相比较，差异均无统计学意义(分别为F=1.290，P=0.866>0.05和F=1.714，P=0.474>0.05)；DFO联合As2O3用药组对高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的抑瘤率为25.49％，移植瘤重量为(1.95±0.39)g，与生理盐水对照组相比较，明显低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(F=0.028，P=0.019<0.05)，提示DFO联合As2O3用药对HL-60高致瘤细胞裸鼠异种移植瘤的生长具有抑制作用，DFO联合As2O3在抑制高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的生长上具有协同作用。
　　 5.荷瘤裸鼠在处死后，肉眼观察各组移植瘤组织，可见出血坏死区，有的瘤块表面可见黑色痂样改变。光镜下可见，对照组瘤细胞分布密集，瘤细胞圆形或椭圆形，细胞胞体较大，大小基本一致，明显异型，核大而深染，胞浆量少，呈嗜碱性，可见个别凋亡细胞及凋亡小体，内有散在的局灶性细胞坏死区；各治疗组移植瘤组织中瘤细胞数目明显较生理盐水对照组减少，细胞体积变小，核深染，有的细胞固缩，有的仅存胞核，可见不规则坏死、出血，呈片状的嗜伊红结构，凋亡细胞和凋亡小体小片状分布，其中以DFO联合As2O3用药组较DFO单药组和As2O3单药组显著。
　　 6.荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾病理组织学检查结果显示：在显微镜下观察可见，每只荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾组织，结构完整，除充血程度不同外，均无明显的病理改变，未见HL-60白血病细胞转移。
　　 7.荷瘤裸鼠骨髓病理组织学检查结果显示：4组均可见有核细胞增生活跃，粒红比例正常，未见明显的骨髓抑制和HL-60白血病细胞浸润。
　　 8.免疫组织化学PowerVisionTM二步法检测移植瘤组织NF-к Bp65的表达，统计学结果显示：DFO单药组，As2O3单药组与DFO联合As2O3用药组3个治疗组的平均积分光密度值均低于生理盐水对照组，与生理盐水对照组比较均有统计学差异(P<0.05)；且NF-К Bp65表达的积分光密度值：生理盐水对照组>As2O3单药组>DFO单药组>DFO联合As2O3用药组。4组两两相互比较差异均有统计学意义(P<0.05)。提示DFO和As2O3都可降低高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤组织的NF-к Bp65表达，二者联合降低移植瘤组织NF-к Bp65表达的作用更强。
　　 结论：
　　 1.采用高致瘤性HL-60白血病细胞(1×106个细胞/只)在裸鼠皮下接种，可成功建立移植瘤动物模型，接种后7～8天均能形成直径约0.5cm～1.0cm大小的移植瘤，成瘤率达100％，且成瘤后瘤体生长迅速。
　　 2.DFO和As2O3单药应用均可抑制高致瘤HL-60白血病细胞裸鼠异种移植瘤的生长，二者联合作用显著。
　　 3.DFO联合As2O3应用荷瘤裸鼠能较好耐受，DFO可降低As2O3用量，促进其杀伤肿瘤作用，且可降低As2O3毒副作用。
　　 4.DFO和As2O3均可降低高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤组织的NF-к Bp65的表达水平，二者联合降低移植瘤组织NF-к Bp65表达的作用更明显。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

6 结论

7 参考文献

8 附图

综述部分

参考文献

缩略词中英文对照表

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢