游离SiO2粉尘致肺成纤维细胞激活前后差异蛋白质筛选

摘要

矽肺是尘肺病中发病快、病情严重、预后较差的一种,也是我国目前患病人数最多、危害性最大的一种职业病。矽肺的发病机制目前仍不清楚,矽肺的基本病理变化是以形成矽结节为主和有一定间质性纤维增生。在纤维化的发展过程中,肺成纤维细胞是一种重要的效应细胞。肺成纤维细胞被激活,转变为肌成纤维细胞是纤维化过程中的一种重要改变。肺成纤维细胞激活前后,蛋白质分泌及合成发生相应的改变,蛋白质组学技术是进行蛋白质表达研究的有力手段。
　　 目的
　　 利用双向凝胶电泳技术分离激活和未激活的肺成纤维细胞表达的差异蛋白质,并对差异蛋白质进行鉴定,为探讨矽肺生物标志提供相关依据和基础资料。
　　 方法：
　　 1.实验组和对照组分别使用经SiO2刺激和未经SiO2刺激的大鼠肺巨噬细胞上清液,刺激大鼠肺成纤维细胞,分别得到激活和未激活的肺成纤维细胞。
　　 2.应用固相IPG梯度胶条,进行双向凝胶电泳,分离激活前后的肺成纤维细胞的血清总蛋白,凝胶经银染显色后,用Amersham扫描仪获得凝胶图像。经ImageMaster2D Platinum6.0专用凝胶图像分析软件进行分析后,找出有差异的蛋白点。
　　 3.从凝胶上挖下部分差异表达的蛋白点,使用胰蛋白酶进行胶内原位酶切,经MALDI-TOF-MS仪分析获得的肽质量指纹图,然后利用Mascot查询软件搜寻数据库鉴定蛋白质。
　　 结果：
　　 (1)获得了较好的双向电泳银染图谱。经图像分析检测发现2块胶斑点匹配率达75％。
　　 (2)实验组和对照组的双向电泳图谱经ImageMaster2D Platinum6.0软件匹配分析,共筛选出13个差异的蛋白点,其中编号为1-4的蛋白点只在激活的肺成纤维细胞中表达；编号为5-7的蛋白点只在未激活的肺成纤维细胞中表达；编号为8-11的蛋白点在激活的肺成纤维细胞中高表达；编号为12、13的蛋白点在未激活的肺成纤维细胞中高表达。
　　 (3)从13个差异蛋白点中选出7个蛋白点,经胶内原位酶切-质谱指纹图谱分析,获得了6张肽质量指纹图谱,经数据库查询分析,成功鉴定出6个蛋白质分别为:不均一核糖核蛋白A2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotelnA2)、胶转蛋白2(transgelin2)仅在激活后表达,3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate-dehydrogenase)、波形蛋白,CRA-b亚型(vimentin,isoform CPA-b)、过氧化还原酶5(peroxiredoxin5)在激活后高表达,角蛋白K6(keratin K6)在激活前高表达。
　　 结论：
　　 (1)肺成纤维细胞激活前后的蛋白质组表达存在差异。
　　 (2)不均一核糖核蛋白A2、胶转蛋白2、3-磷酸甘油醛脱氢酶、波形蛋白(CRA-b亚型)、过氧化还原酶5、角蛋白K6可能是肺纤维化过程的潜在生物标志。

目录

文摘

英文文摘

图和附表清单

符号说明

1 引言

1.1 研究目的和意义

1.2 问题的提出

1.3 选题的背景

1.4 研究方法

1.5 论文结构安排

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 实验材料

2.3 实验方法

3 结果

3.1 肺成纤维细胞的体外培养彤态及激活后α-SMA的表达

3.2 Bradford法标准曲线及蛋白质浓度

3.3 肺成纤维细胞激活前后的2-DE图谱及其比较分析

3.4 差异蛋白点的MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱分析

4 讨论

4.1 蛋白质组学及2-DE技术方面

4.2 差异蛋白质的功能分析

5 结论

参考文献

矽肺、肺纤维化及肺成纤维细胞蛋白质组学研究进展

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢