耐辐射球菌DR2539 DR2263突变体的构建与功能分析

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之一。研究耐辐射球菌强辐射抗性的机理对于运用该菌进行放射性废料的处理及肿瘤发生机制的研究都具有很强的潜在的应用价值。目前认为它之所以具有这种极端的辐射抗性特征是因为它拥有高效的DNA修复能力和超强的抗氧化能力。最近有研究显示，细胞内积累的锰铁离子比例与其辐射抗性正相关。耐辐射球菌细胞内也积累了相对较高的锰铁离子比例，二价锰离子复合物可能在其抗辐射机制中发挥了重要作用，二价锰离子可以通过自身发生氧化还原反应来清除辐射诱导产生的羟自由基，减轻了辐射对胞内蛋白质的攻击，从而使得参与DNA修复的各种酶类的活性得以维持，因而其在辐射条件下仍具有高效的DNA修复能力。目前已经在耐辐射球菌中鉴定出两类锰离子转运蛋白，它们分别是MntH类的DR1709和MntABC类的DR2523、DR2283、DR2284。然而，耐辐射球菌细胞内参与锰离子运输调节和维持其细胞内锰铁离子平衡的机制还不清楚。研究耐辐射球菌细胞内参与调节锰铁离子平衡的基因，对进一步阐明其辐射抗性机制和探索其潜在的应用价值具有非常重要的意义。
　　 DR2539是耐辐射球菌细胞内一种重要的调控基因，它编码一种转录因子，可能参与锰铁离子的转运调节。DR2263编码一种Dps(DNA protection during starvation)蛋白。 Dps蛋白通过两种机制来保护DNA不受辐射损伤：(1)Dps蛋白直接与DNA相结合而保护DNA免受氧自由基的攻击。(2)Dps与细胞内游离的亚铁离子结合，阻止了其与水发生Feton反应，避免产生过多的自由基来保护DNA。因此，Dps蛋白可能在维持细胞内锰铁离子平衡中起了重要作用。
　　 本研究主要对这两个基因的功能进行了分析。研究结果如下：
　　 1：基因DR2539与革兰氏阳性菌中的dtxR基因类似，主要的生理作用是调节铁离子的吸收；与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的mntR基因也有一定的同源性，参与锰离子运输的调节。基因DR2263编码的Dps含有特定的ferritin(铁蛋白)结构域，该蛋白为铁蛋白超家族的成员。
　　 2：用体外三段连接和体内同源重组的方法构建了基因DR2539和基因DR2263的缺失突变体，分别命名为M2539和M2263。通过测定突变株和野生株在不同锰铁离子浓度的培养基中的生长曲线，发现M2263和野生株的生长差异不明显，但是，M2539却在低锰的培养基中生长明显减慢。通过测定突变株和野生株对二价锰离子和二价铁离子的最小抑菌浓度(MIC)发现，M2263和野生株有着相同的MIC。但是，M2539对二价锰离子的敏感性显著增强。通过测定突变株和野生株在不同浓度的二价锰、铁离子培养基中培养的条件下细胞内锰铁离子的含量，发现M2263的细胞内锰、铁离子含量与野生株相差不大，但是生长在高浓度二价锰离子培养基中的M2539却具有很高的细胞内的锰离子含量和锰铁比例。通过测定突变株和野生株对过氧化氢和甲基紫荆的抗性，发现M2263和M2539与野生株有着相似的抗性。通过测定突变株和野生株的蛋白酶的水解圈后发现，M2263和M2539与野生株蛋白酶分泌能力相差不大。
　　 综上所述，耐辐射球菌基因DR2539可能在调节锰离子平衡过程中发挥了重要作用，DR2539对锰离子的运输的调节具有双重作用，其更多可能类似于mntR。基因DR2263的敲除对耐辐射球菌影响不大，可能其功能被其它基因所替代。鉴于DR2539在调节锰离子平衡过程中所发挥的重要作用，基因DR2539的启动子如何应答外界锰铁离子浓度变化以及DR2539与锰离子转运蛋白的相互作用值得深入研究。

目录

文摘

英文文摘

图和附表清单

1 耐辐射球菌的研究综述

1.1 耐辐射球菌的发现、分类及意义

1.2 耐辐射球菌的形态、生理特征

1.3 耐辐射球菌的基因组

1.4 耐辐射球菌的抗辐射机制

1.4.1 DNA修复机制

1.4.2 抗氧化机制

1.5 研究内容及技术路线

2 耐辐射球菌基因DR2539和DR2263的生物信息学分析

2.1 生物信息学材料与方法

2.1.1 生物信息学材料

2.1.2 生物信息学分析方法

2.2 生物信息学结果分析与讨论

2.2.1 基因位置和序列

2.2.2 基因密码子偏好分析

2.2.3 基因的启动子预测分析

2.2.4 Motif在线分析

3 耐辐射球菌DR2539和DR2263突变体的构建

3.1 实验菌株及生长特性

3.2 主要试剂和仪器

3.3 突变体的构建方法

3.3.1 耐辐射球菌基因组DNA的制备

3.3.2 pRADK质粒的提取

3.3.3 耐辐射球菌感受态细胞的制备和转化

3.3.4 DR2539突变体的构建

3.3.5 DR2263突变体的构建

3.3.6 突变体的鉴定

3.4 结果和分析

4 突变体的表型分析

4.1 主要的试剂和仪器、设备

4.2 材料和方法

4.2.1 耐辐射球菌在不同培养基中的生长曲线的测定

4.2.2 耐辐射球菌对Mn2+、Fe2+及其它有毒金属的抗性测定

4.2.3 耐辐射球菌细胞内锰铁离子含量的测定

4.2.4 耐辐射球菌过氧化氢抗性和甲基紫荆抗性测定

4.2.5 耐辐射球菌蛋白酶分泌功能测定

4.3 结果和分析

4.3.1 耐辐射球菌生长曲线测定

4.3.2 耐辐射球菌金属抗性测定

4.3.3 耐辐射球菌细胞内锰铁离子含量的测定

4.3.4 耐辐射球菌过氧化氢抗性和甲基紫荆抗性测定

4.3.5 耐辐射球菌蛋白酶分泌功能测定

4.4 讨论

参考文献

致谢

附录 缩略词及中文对照

个人简历及硕士期间发表论文