bFGF、SCF诱导人脐血CD34+、CD133+细胞基因表达变化的研究

摘要

研究背景与目的：
　　碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，具有较为广泛的生物学活性，可诱导多种细胞的增殖与分化，在血管生长、创伤愈合、组织再生和修复、神经再生等方面均有重要作用。bFGF已较广泛的用于神经损伤再生的研究，并从基础研究走向临床应用。文献显示，bFGF可体外诱导人脐血单个核细胞向多种神经细胞的分化，将该细胞给神经损伤动物模型移植，有明显神经修复作用。由于bFGF具备生物活性的多效性和神经营养的广谱性，且基因重组的人类bFGF也已问世，bFGF显露出光明的临床应用前景。但迄今为止，bFGF诱导脐血单个核细胞分化的机制尚不清楚，为探讨bFGF对不同分化阶段造血干/祖细胞分化的影响、促进bFGF诱导脐血单个核细胞的临床应用，本研究利用基因芯片技术，分析bFGF、SCF体外诱导脐血CD34+和CD133+细胞分化的基因表达变化，为探讨bFGF诱导脐血CD34+和CD133+细胞分化机制提供理论支持和实验数据，为相关细胞生物学临床应用打下基础。
　　方法：
　　利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34+和CD133+细胞，流式细胞仪检测CD34+和CD133+细胞分选纯度;经含有干细胞因子(SCF)、bFGF、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10-15d，显微镜下观察bFGF诱导前后CD34+细胞和CD133+细胞形态变化;提取培养前后细胞总RNA，变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA的浓度和纯度，利用Oligo GEArray(2)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析。
　　结果：
　　(1)分选CD34+细胞和CD133+细胞纯度:对20份脐血分别进行CD34+细胞和CD133+细胞分选，CD34+细胞纯度为(77.52±5.06)％，回收率为(2.74±1.59)％;CD133+细胞纯度为(79.16±3.37)％，回收率为(1.12±0.94)％。再次过柱分选后CD34+和CD133+细胞纯度均可达90％以上，台盼兰染色活细胞比率达95％以上。
　　(2)培养前后CD34+细胞、CD133+细胞形态:新分选的CD34+细胞、CD133+细胞均呈球形，经bFGF、SCF联合培养15天后，细胞明显扩增，计数扩增2-3倍。多数细胞形态变化不明显，部分细胞呈现出不规则形，部分细胞贴壁生长。
　　(3)培养前后CD34+细胞基因变化:对细胞因子诱导前后的CD34+细胞进行了263个干细胞相关基因的检测，发现培养后有10个基因表达上调，20个基因表达下调;在细胞分化标志中，造血细胞系标志CD19、CD3D表达下调，间叶细胞系标志PPARG、SPP1表达上调，神经细胞系标志S100B表达上调，说明CD34+细胞在bFGF诱导下向间叶细胞和神经细胞分化的趋势增强。
　　(4)培养前后CD133+细胞基因变化:对细胞因子诱导前后CD133+细胞进行了263个干细胞相关基因的检测，CD133+细胞在培养后有21个基因表达显著上调，7个基因表达显著下调;这些基因主要涉及干细胞特异性标志、细胞周期、干细胞分化标志、以及与干细胞相关的信号转导、细胞因子及其受体等。培养后，血细胞系标志CD3D、CD247表达降低，CD4表达增加，间叶细胞系标志PPARG、SPP1表达增加，神经细胞系标志S100B表达增加。说明CD133+细胞在bFGF诱导下向间叶细胞和神经细胞分化的趋势增强。
　　(5)在所检测的263个干细胞相关基因中，脐血CD133+细胞与CD34+细胞基因表达差异2倍以上的基因仅有10种;bFGF诱导培养后，CD133+细胞有32种基因表达显著高于CD34+细胞，在检测的263个基因中，未见低于CD34+细胞的基因。
　　结论：
　　在检测的263个干细胞相关基因中，脐血CD133+细胞和CD34+细胞基因表达仅有少数基因存在差异;CD133+细胞对bFGF的反应性显著强于CD34+细胞，表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强;CD34+细胞和CD133+细胞经bFGF、SCF诱导后向间叶细胞和神经细胞分化趋势增强。