植物角质膜蜡质转录因子基因SHN1/WIN1的表达载体构建

摘要

在植物的生命活动中常遭受病害，虫害，旱害，紫外线损伤等一系列环境胁迫。植物为了保护自身免遭各种胁迫，在其表面形成一种角质膜的结构，是植物与外部环境之间的第一道屏障。角质膜组分沉积在植物地上部分外表皮细胞壁的表面，主要由角质和蜡质组成，蜡质组分沉积在角质的表面或嵌插在其中间，这种半刚性疏水结构使角质膜成为有效防水和保护内部组织的屏障。角质膜的成分和渗透性会影响植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗力。目前在植物抗逆基因工程领域，通过转录因子来提高植物的抗逆性成为研究热点。从拟南芥中分离的与蜡质相关的转录因子WIN1/SHN1，可通过直接或间接地激活角质和蜡质生物合成途径中编码酶的基因的转录，在拟南芥中过表达，使得角质膜的渗透性改变，能增加蜡质含量，提高植物的抗旱性。
　　 本试验选取了大叶黄杨(Euonymusjaponicus)，辣椒(Capsicumfrutescens)为研究材料，首先通过酶处理法得到大叶黄杨叶片和辣椒果实的角质膜，通过扫描电子显微镜观察分析角质层纹饰的走向，蜡质和角质的超微结构，得出大叶黄杨叶片蜡质层厚而密，呈片状结构，角质的网状结构孔径相对较小而规则；而辣椒果实的蜡质层薄，蜡质晶体堆积，分布不均匀，角质的网状结构孔径大，不规则。
　　 本实验以野生型拟南芥花蕾中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增到与角质和蜡质合成相关的转录因子基因，该目的基因片段SHN1/WIN1(SHN1/WAXINDUCER1约600bp，将此片段克隆到PMD-19T载体上，经测序分析与Genbank中报道的序列的同源性为100％。以植物表达载体PBI121为基础，构建了由组成型启动子CaMV35S调控的SHN1/WIN1基因的植物表达载体PBI121-SHN1/WIN1;通过冻融法将PBI121-SHN1/WIN1载体转入了根癌农杆菌LBA4404，为利用SHN1/WIN1基因改变植物角质膜的结构和成分，提高植物抗逆性特别是抗旱性能奠定了物质基础。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 植物角质膜的组分、结构和功能

1.1.1 植物角质膜的组分和结构

1.1.2 植物角质膜的功能

1.2 植物角质膜蜡质的生物合成途径

1.2.1 酰基还原途径

1.2.2 脱羰基途径

1.3 表皮蜡质组分转运的途径

1.3.1 表皮蜡质组分转运到质膜的途径

1.3.2 蜡质组成成分从质膜到质外体的运输途径

1.3.3 蜡质组分从细胞壁到达表皮的运输途径．

1.4 植物AP2/EREBP转录因子的研究

1.4.1 AP2/EREBP转录因子的结构及分类

1.4.2 AP2/EREBP在逆境胁迫中的作用

1.4.3 植物蜡质相关转录因子的研究

1.5 论文研究的目的及意义

2 植物角质膜的结构

2.1 实验材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 试剂配制

2.1.5 试验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 大叶黄杨角质膜的表面特征

2.2.3 辣椒角质膜的表面特征

2.3 讨论

3 蜡质相关转录因子基因SHN1/WIN1的克隆

3.1 试验材料与仪器

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验仪器

3.2 试验方法

3.2.1 拟南芥花蕾的获取

3.2.2 RNAiso Reagent提取拟南芥总RNA

3.2.3 反转录

3.2.4 PCR反应扩增目的片段

3.2.5 PCR产物的胶纯化回收

3.2.6 PCR产物胶纯化回收片段与T-载体的连接

3.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

3.2.8 连接产物的大肠杆菌转化．

3.2.9 阳性克隆的鉴定

3.2.10 测序与菌种保存

3.3 结果与分析

3.3.1 拟南芥RNA的完整性

3.3.2 RT-PCR结果

3.3.3 重组质粒的酶切鉴定

3.3.4 重组质粒PMD-SHN1/WIN1的测序结果

3.4 讨论

4 SHN1/WIN1植物表达载体的构建

4.1 试验材料与仪器

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 生化试剂

4.1.3 分子生物学试剂盒及酶

4.1.4 试剂配制

4.2 试验方法

4.2.1 提取重组质粒PMD-SHN1/WIN1

4.2.2 载体PBI121质粒提取

4.2.3 质粒的酶切与回收

4.2.4 目的基因与表达载体PBI121连接与转化

4.2.5 阳性克隆的鉴定

4.2.6 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备

4.2.7 PBI121-SHN1/WIN1向农杆菌感受态细胞的转化

4.2.8 PBI121-SHN1/WIN1质粒转化农杆菌的PCR验证

4.3 结果与分析

4.3.1 载体PBI121的酶切结果

4.3.2　PBI121-SHNI/WINI表达载体PCR检测

4.3.3 PBI121-SHN1/WIN1表达载体的酶切鉴定

4.3.4 PBI121-SHN1/WIN1质粒转化农杆菌的PCR检测

4.4 讨论

4.3.1 质粒的提取

4.3.2 质粒的酶切

4.3.3 载体pBI121-SHN1/WIN1的构建

4.3.4 农杆菌感受态细胞的制备及转化

5 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果