人Bmi-1基因真核表达载体的构建、鉴定及其对乳腺癌MDA-MB-468细胞的效应

摘要

背景和目的
　　 乳腺癌是严重危害妇女健康的一种疾病。Bmi-1基因(B-cell specificmoloney leukemia virus insert site l,Bmi-1)是PcG(polycomb group genes)家族重要的调节基因,位于人类10号染色体短臂1区3带(10p13),在调节细胞周期及增殖方面具有重要作用。研究发现,Bmi-1基因在乳腺癌及乳腺癌细胞系中高表达,与乳腺癌的发生发展密切相关,但其作用机制仍不清楚。
　　 研究显示,在人正常鼻咽上皮细胞中过表达Bmi-1基因后,能够激活hTERT的转录,诱导端粒酶活性并维持端粒在一定的长度,并且能够下调p16INK4a的表达,影响细胞周期及增殖,促使人正常鼻咽上皮永生化。此外,Bmi-1基因可以维持胚胎干细胞和肿瘤干细胞的自我更新及增殖活性,目前已有研究证明,在人神经胶质瘤U87细胞中,过表达Bmi-1基因后,能够上调Oct-4的表达,提示Bmi-1基因可能在干细胞水平参与了神经胶质瘤的发生与发展。
　　 在以往研究的基础上,本研究构建人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1。转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞48h后,RT-PCR鉴定目的基因Bmi-1的mRNA表达变化,以G418进行筛选,建立了pcDNA3.1(+)-Bmi-1真核表达载体稳定转染的乳腺癌细胞系。应用免疫细胞化学方法验证Bmi-1基因蛋白水平上的表达变化。应用RT-PCR的方法检测Bmi-1基因mRNA水平上的表达变化。通过MTT技术检测pcDNA3.1(+)-Bmi-1表达载体对MDA-MB-468细胞的影响,为进一步深入探讨Bmi-1基因在乳腺癌中发生作用的分子机制提供实验基础。
　　 材料与方法
　　 1.主要材料:人乳腺癌MDA-MB-468细胞由郑州大学中英医学实验室馈赠；真核表达载体pcDNA3.1(+)由郑州大学生化教研室臧明玺教授及郑州大学组胚教研室杨继要老师惠赠。
　　 2.构建pcDNA3.1(+)-Bmi-1真核表达载体:采用半定量RT-PCR的方法检测乳腺癌MDA-MB-468细胞及MCF-7细胞中Bmi-1mRNA的表达。从MCF-7细胞中提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增Bmi-1 cDNA全长。将Bmi-1基因片段经T-A克隆后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1,酶切、电泳及测序鉴定。
　　 3.细胞培养及转染:乳腺癌MCF-7细胞培养于含有10％FBS的RPMI1640培养基中,37℃,5％CO2培养箱中贴壁培养；乳腺癌MDA-MB-468细胞于含有10％FBS的DMEM高糖培养基中,37℃,5％CO2培养箱中贴壁培养。转染MDA-MB-468细胞前,更换新鲜培养基。采用高纯度中量质粒提取试剂盒抽提pcDNA3.1(+)与pcDNA3.1(+)-Bmi-1。MDA-MB-468细胞随机分为重组质粒转染组,空载体组和空白对照组,用Lipofecter脂质体转染试剂将pcDNA3.1(+)-Bmi-1导入重组载体转染组,将。pcDNA3.1(+)导入空载体组,空白对照组未转染质粒。
　　 4.筛选与扩增:转染后的细胞铺满培养板后,按1:4的密度比传代至新的培养板。于含有1mg/mlG418的DMEM高糖选择性培养基中筛选,每3d更换一次培养基,至第7天,空白对照组细胞死亡,改用400μg/ml的选择性培养基继续筛选,约2w后,阳性细胞克隆形成,将单克隆细胞挑入24孔板,继续培养。细胞铺满培养板后,移入培养瓶扩大培养。
　　 5.pcDNA3.1(+)-Bmi-1表达载体对乳腺癌MDA-MB-468细胞的效应:应用免疫细胞化学检测Bmi-1、hTERT、p16INK4a及Oct-4蛋白表达水平的变化；应用RT-PCR检测Bmi-1及hTERT的mRNA表达水平变化;应用MTT法检测细胞增殖情况的改变。
　　 6.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理,数值用(X)±S表示。采用单因素方差分析进行组见差异比较,以a=0.05为检验水准。
　　 结果：
　　 1.真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1的构建:Bmi-1 mRNA在MCF-7细胞中表达较高,而在MDA-MB-468细胞中仅适量表达；从MCF-7细胞中提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增Bmi-1 cDNA全长,并通过胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化；T-A克隆后,行菌液PCR、酶切图谱验证重组阳性克隆；对pcDNA3.1(+)-Bmi-1进行酶切和序列分析,酶切图谱及插入序列与预期结果一致。
　　 2.瞬时转染MDA-MB-468细胞:3组细胞中Bmi-1及hTERT的mRNA相对表达量分别为:重组载体转染组,0.943±0.095和0.396±0.015。空载体组,0.603±0.015和0.244±0.007。空白对照组,0.600±0.014和0.240±0.006。重组质粒转染组Bmi-1及hTERT的mRNA表达水平高于空载体组和空白对照组(P<0.05)。
　　 3.稳定转染后Bmi-1及hTERT的表达:3组细胞中Bmi-1和hTERT的蛋白相对表达量分别为:重组载体转染组,8.77±1.12和6.59±0.40。空载体组,6.05±0.43和4.66±0.39。空白对照组,6.07±0.35和4.17±0.58。3组细胞中Bmi-1和hTERT的mRNA相对表达量分别为:重组载体转染组,1.001±0.040和0.402±0.018。空载体组,0.628±0.034和0.263±0.022。空白对照组,0.600±0.033和0.266±0.321。重组质粒转染组Bmi-1、hTERT的表达水平高于空载体转染组和空白对照组(P<0.05)。
　　 4.稳定转染后p16INK4a及Oct-4的蛋白表达:3组细胞中p16INK4a和Oct-4的蛋白相对表达量分别为:重组载体转染组,2.90±0.33和4.09±0.14。空载体组,5.28±0.34和2.14±0.19。空白对照组,4.96±0.37和2.18±0.15。重组质粒转染组p16INK4a蛋白表达水平低于空载体组和空白对照组(P<0.05),而重组质粒转染组Oct-4的蛋白表达水平高于空载体组和空白对照组(P<0.05)。
　　 5.稳定转染后MTT结果:3组细胞吸光值分别为:重组质粒转染组,0.718±0.015。空载体组,0.481±0.009。空白对照组,0.506±0.010。与其它两组相比,重组质粒转染组细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.构建了人Bmi-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1.
　　 2.建立了稳定高表达Bmi-1的乳腺癌细胞系。
　　 3.真核表达载体pcDNA3.1(+)-Bmi-1转染乳腺癌MDA-MB-468细胞后,Bmi-1表达活性增高,并且其过表达可上调hTERT及Oct-4的表达,下调p16INK4a的表达,并有效增强乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖能力。

目录

文摘

英文文摘

中英文缩写词索引

前言

1.主要材料

2.实验方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

附图

综述 BMI-1基因与肿瘤关系的研究进展

参考文献

致谢