弗氏链霉菌S.fradiae S-221角蛋白酶基因的异源表达及酶学性质研究

摘要

本文主要研究了来源于弗氏链霉菌S.fradiae S-221的角蛋白酶基因的克隆和表达及蛋白酶纯化、酶学性质和酶底物切点的分析。1、角蛋白酶基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌S.lividans TK24中的表达。其中，去除链霉菌外分泌信号肽(38aa)编码区的角蛋白酶原序列的基因命名为sfk，其在大肠杆菌的表达中以包含体的形式存在；而角蛋白酶成熟酶(191aa)带有一段N端前导肽（78aa）以及链霉菌外分泌信号肽(38aa)的基因命名为sfks，其在变铅青链霉菌S.lividansTK24中获得成功表达。2、sfks基因获得成功表达后，该异源表达的角蛋白酶通过硫酸铵沉淀、阴离子交换柱和分子筛技术获得纯化，纯化后的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量约为19.1kDa。该纯化蛋白经BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定，其浓度约为27.3μg/ml。3、在pH9.0的Tris-HCl缓冲液中，纯化后的角蛋白酶其最适反应温度为37℃，并能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制，进一步证明本实验获得的角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶家族；另外，其降解天青角蛋白的活性在加入二硫苏糖醇(DDT)后有极大提高，DDT能够使已发生聚集的晶体蛋白发生分子之间的二硫键解离，从而为角蛋白酶降解天青角蛋白底物提供了方便。同时，在酶活性方面的研究中，酪蛋白、弹性蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和天青角蛋白作为可被降解的底物。4、为了进一步进行底物酶切位点的研究，绿色荧光蛋白和酪蛋白被角蛋白酶降解后，其降解的肽段通过LC-MS QTOF技术分析。该角蛋白酶可能没有特异性的酶切位点，而是把底物切成肽段，该现象展示了此蛋白酶新的酶切方式，该种新酶切方式的研究意义非常远大。

目录

文摘

英文文摘

1 文献综述

1.1 角蛋白酶综述

1.1.1 角蛋白酶的微生物来源

1.1.2 角蛋白酶的性质

1.1.3 微生物角蛋白酶降解角蛋白的研究

1.1.4 角蛋白酶的功能和用途

1.1.5 角蛋白酶基因的克隆和表达

1.2 弹性蛋白酶综述

1.2.1 弹性蛋白酶的微生物来源

1.2.2 弹性蛋白的性质和结构

1.2.3 弹性蛋白酶降解弹性蛋白的机理研究进展

1.2.4 弹性蛋白酶基因的克隆和表达

1.2.5 弹性蛋白酶的功能与用途

2 角蛋白酶表达纯化和性质研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 缓冲液、培养基和生长条件

2.2 实验方法和步骤

2.2.1 sfk基因的克隆与鉴定

2.2.2 表达载体构建

2.2.3 转化

2.2.4 重组蛋白的表达与检测

2.2.5 蛋白酶的纯化方法

2.2.6 酶活性测定

2.2.7 生物信息学分析和常用的软件

2.3 结果与讨论

2.3.1 蛋白基因与蛋白序列分析

2.3.2 sfks基因的表达研究

2.3.3 角蛋白酶酶学性质的研究

3 问题与展望

3.1 目前存在的问题

3.1.1 链霉菌表达系统的构建及应用

3.1.2 不溶性底物对酶学性质研究的限制

3.1.3 角蛋白酶酶切方式的研究

3.1.4 角蛋白酶对弹性蛋白降解的研究

3.2 前景展望

3.2.1 加强角蛋白酶的分子改良

3.2.2 加强角蛋白酶的表达调控机理和酶解角蛋白作用机理的研究

3.2.3 加强基因工程的应用研究

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果