Notch1参与调节食管鳞状细胞癌中Srcasm负调控活化Src酪氨酸激酶的机制研究

摘要

食管癌分布于世界各地,我国是食管癌的高发区,食管癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的21.8％,其中河南省食管癌死亡占全省总癌死亡的40％左右,平均每年因食管癌死亡约25000人。食管癌发生于食管粘膜上皮的基底细胞,在我国等食管癌的高发区,病理类型以鳞状上皮细胞癌为主,占95％左右,以食管鳞状细胞癌为研究对象具有明显的现实意义。虽然经过数十年的研究我们认为食管癌的发生与亚硝胺类化合物、微量元素的缺乏、遗传易感性等因素有关,但其确切的发病机制仍然不清楚,这也是造成目前其治疗效果不令人满意的关键因素。食管粘膜表面被覆复层鳞状上皮组织,正常食管粘膜上皮组织具有自我更新能力,维持上皮细胞生长与终止分化。而控制食管上皮组织从分化状态转变为增生状态是我们解开食管上皮疾病的一把钥匙,尤其在食管癌的发生机制研究方面意义重大。相关研究为我们探索食管癌的发生机制提供了可能,也为食管癌的基因治疗提供了理论依据。
　　 SRC家族酪氨酸激酶(SFKs)包括至少9种结构高度相似的非受体酪氨酸激酶,分别是Src、Fyn、Yes、LcK、Hck、Lyn、Blk、Yrk、Fgr。Src酪氨酸激酶由N端豆蔻酰化序列、单一序列、SH2结构域、SH3结构域、激酶域、C端调节域等结构组成。其籍N端豆蔻酰基锚定在质膜内侧；SH2结构域由约100个氨基酸残基组成,专一性识别并结合含有磷酸酪氨酸的一段短肽；SH3结构域由约50个氨基酸残基组成,通过脯氨酸及疏水氨基酸残基与靶蛋白结合；激酶域含正调节自磷酸化位点Y416；C端调节域含负调节磷酸化位点Y527。SH3域在细胞骨架的重组装及Src蛋白的转运方面具有重要意义,而SH2域和激酶域在信号转导中扮演重要的角色。在正常细胞中,由于羧基末端Src激酶(carboxyterminal Src kinase,CSK)的存在,Y527发生磷酸化,磷酸Y527和SH2域结合,使SFKs蛋白头尾卷曲而处于抑制状态:但发生癌变或处于有丝分裂期的细胞,Y527解磷酸化和Y416自身磷酸化.使得SFKs蛋白处于开放构象而被激活。
　　 由于历史的因为,Src酪氨酸激酶在肿瘤方面的研究多集中于鸟类及哺乳动物成纤维细胞以及人类造血系统细胞方面。最近,多项研究显示Src酪氨酸激酶活性水平的异常升高与人类结肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等多种上皮起源肿瘤的发生相关。理论上,酪氨酸激酶活性突变和或负调控机制受损是肿瘤组织中其水平异常增高的可能机制,然而Src酪氨酸激酶活性突变在这些肿瘤中很少发生,故负调控机制受损可能是肿瘤组织中Src酪氨酸激酶水平异常增高的主要机制。Srcasm是新近发现的Src酪氨酸激酶的作用底物和负调控因子,Notch1属于Ⅰ型跨膜蛋白,在人皮肤鳞状细胞癌中其可能参与Srcasm负调控Src酪氨酸激酶的作用机制。
　　 活化Src酪氨酸激酶(Tyr416)在食管鳞状细胞癌的发生发展中扮演了何种角色?在食管鳞状细胞癌中是否存在Srcasm对其的负调控作用机制?人食管鳞状细胞癌中Notch1是否也参与该负调控机制?本研究对此问题进行探究,试图发现其与食管鳞状细胞癌发生的关系并揭示其可能的负调控机制。
　　 本论文的内容分为以下三部分:
　　 第一部分实验材料和方法介绍
　　 试剂配制方法参考《Experimental Directory of Medical College of Universityof Pennsylvania》。涉及的主要实验方法包括:免疫组织化学方法、细胞免疫荧光方法、组织免疫荧光方法、免疫印迹方法、腺病毒载体的感染、细菌的转化、质粒DNA的抽提、质粒的转染、组织和细胞蛋白质的抽提等。
　　 第二部分活化Src酪氨酸激酶、Srcasm及Notch1与食管鳞状细胞癌之间关系的研究
　　 目的:
　　 观察食管鳞状细胞癌中活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1的表达,探索它们与食管鳞状细胞癌发生发展之间的关系。
　　 方法：
　　 1.免疫组织化学法观察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鳞状细胞癌组织中表达。
　　 2.组织免疫荧光法观察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鳞状细胞癌组织中表达。
　　 3.免疫印迹法观察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在食管鳞状细胞癌组织中表达。
　　 4.细胞免疫荧光法观察活化Src酪氨酸激酶、Srcasm和Notch1在人食管鳞状细胞癌TE1细胞株和食管上皮细胞EPC2-htert细胞株中的表达。
　　 结果：
　　 1.Tyr416在食管鳞状细胞癌组织中高表达,在正常食管粘膜组织中低表达。
　　 2.Tyr416在人食管鳞状细胞癌TE1和TE9细胞株中高表达,在食管粘膜上皮细胞株EPC1-htert和EPC2-htert中低表达。
　　 3.Tyr416在食管鳞状细胞癌组织中的表达高于正常食管粘膜组织,P<0.01,差异有统计学意义。
　　 4.Srcasm在食管鳞状细胞癌组织中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达。
　　 5.Srcasm在人食管鳞状细胞癌TE1和TE9细胞株中低表达,在食管粘膜上皮细胞株EPC1-htcrt和EPC2-htert中高表达。
　　 6.Srcasm在食管鳞状细胞癌组织中的表达低于正常食管粘膜组织,P<0.05,差异有统计学意义。
　　 7.Notch1在食管鳞状细胞癌组织中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达。
　　 8.Notch1在人食管鳞状细胞癌TE1和TE9细胞株中低表达,在食管粘膜上皮细胞株EPC1-htert和EPC2-htert中高表达。
　　 9.Notch1在食管鳞状细胞癌组织中的表达低于正常食管粘膜组织,P<0.05,差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.Tyr416在食管鳞状细胞癌中高表达,在正常食管粘膜组织中低表达,提示Src酪氨酸激酶的活化在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起重要作用。
　　 2.Srcasm在食管鳞状细胞癌中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达,提示Srcasm可能在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起负调控作用。
　　 3.Notch1在食管鳞状细胞癌中低表达,在正常食管粘膜组织中高表达,提示Notch1可能在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起负调控作用,Notch1锚定于细胞膜的蛋白质,可能是食管鳞状细胞癌发生过程中一个重要的上游信号调控分子。
　　 第三部分食管鳞状细胞癌中Srcasm负调控活化Src酪氨酸激酶的作用及其机制的研究
　　 目的:
　　 探索食管鳞状细胞癌中活化Src酪氨酸激酶的负调控机制和该机制包含的可能信号分子。
　　 方法：
　　 1.人pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA载体和人Srcasm腺病毒载体(Ad-Srcasm)转染和感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,筛选较好的作用方法。
　　 2.人pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA载体转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,观察其对活化Src酪氨酸激酶的作用。
　　 3.pcDNA3.1-Notch1质粒DNA载体转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株,观察其对Srcasm的作用。
　　 结果：
　　 1.人pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA载体以脂质体法转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株后,免疫印迹检测Sreasm的表达增高。
　　 2.人Srcasm腺病毒载体(Ad-Srcasm)感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株后,免疫印迹检测Srcasm的表达增高。
　　 3.Quantity-one软件测量灰度,并经β-actin标准化后,pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA转染组的Srcasm蛋白表达水平较Ad-Sreasm腺病毒感染组高。
　　 4.转染递加剂量的pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA,TE1细胞中Srcasm蛋白的表达逐渐增高,而Tyr416蛋白的表达逐渐减低。
　　 5.转染pcDNA3.1-Notch1质粒DNA,原来低表达Srcasm的TE1细胞株(见空白对照组和pcDNA3.1空载体组)中,Srcasm蛋白的表达明显增高。
　　 结论：
　　 1.pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA转染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株是成功的。
　　 2.人Srcasm腺病毒载体(Ad-Srcasm)感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株是成功的。
　　 3.人食管鳞状细胞癌TE1细胞株中pcDNA3.1-Srcasm质粒DNA转染效率较人Srcasm腺病毒载体(Ad-Srcasm)感染高。
　　 4.pcDNA3.1-Notch1质粒DNA转染和感染人食管鳞状细胞癌TE1细胞株是成功的。
　　 5.人食管鳞状细胞癌TE1细胞株中Srcasm对活化Src酪氨酸激酶具有负调控作用。
　　 6.人食管鳞状细胞癌TE1细胞株中Notch1可能是Srcasm的上游信号分子。
　　 全文结论:
　　 1.活化Src酪氨酸激酶是食管鳞状细胞癌发生机制中的一个重要信号分子。
　　 2.在食管鳞状细胞癌中Srcasm对活化Src酪氨酸激酶具有负调控作用。
　　 3.Notch1可能是人食管鳞状细胞癌中Srcasm负调控活化Src酪氨酸激酶的上游信号分子。

目录

文摘

英文文摘

图表清单

引言

第一部分 实验材料和方法

第二部分 活化SRC酪氨酸激酶、SRCASM及NOTCH1与食管鳞状细胞癌之间关系的研究

引言

材料和方法

结果

结果(小结)

结论

第三部分 食管鳞状细胞癌中SRCASM负调控活化SRC酪氨酸激酶的作用及其机制的研究

引言

材料和方法

结果

结果(小结)

结论

讨论

参考文献

全文结论

综述一:SRC酪氨酸激酶与实体肿瘤

参考文献

综述二:NOTCH信号通路与肿瘤

参考文献

缩略语

个人简历

在学期间发表学术论文与研究成果

致谢