克罗卡林对急性脑缺血再灌注大鼠MG、iNOS的影响

摘要

背目的
　　 急性脑梗死是脑血管疾病( cerebrovascular disease，CVD)的最常见类型，约占CVD的70％。脑缺血再灌注是脑缺血缺氧后重新恢复血流的过程，是临床上常见的病理生理现象。缺血再灌注对恢复半暗带区域(Ischemic Penumbra，IP)脑组织的血液供应以及功能改善有重要作用，但缺血再灌注也对脑组织造成一定损伤。
　　 在脑缺血再灌注损伤的过程中，过度炎症免疫反应引起的病理损伤是重要的损伤机制之一。小胶质细胞( microglia，MG)是脑内的主要免疫效应细胞，在中枢神经系统生理和病理过程中起重要作用。小胶质细胞对颅内的内环境改变及其敏感，当脑内环境发生改变时，小胶质细胞迅速激活，产生大量的神经毒性因子，对神经元产生毒性作用，加重对脑部的损害。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是人体内一种重要的合酶，在脑缺血再灌注损伤时诱导合成表达，使钠离子大量内流，导致脑细胞水肿，损害神经元。K-ATP通道开放剂克罗卡林(Cromakalin)以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。K-ATP通道广泛存在中枢神经系统内，也存在小胶质细胞上，它的激活开放是机体缺血缺氧状态下的自我保护机制，可以对抗损害因子对机体的伤害。目前有关K-ATP通道开放剂克罗卡林对脑缺血再灌注损伤的作用以及小胶质细胞、诱导型一氧化氮合酶表达等方面研究较少，机制不清楚。
　　 本研究采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型，观察大鼠急性脑缺血再灌注后神经缺损改变、脑内海马区小胶质细胞激活、诱导型一氧化氮合酶的表达情况，神经元特异性尼氏染色法检测海马区神经元数目及K-ATP通道开放剂克罗卡林干预后的变化，为K-ATP通道开放剂尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
　　 材料与方法:
　　 1．实验动物与分组：72只健康雄性SD大鼠，体重220±30g，随机分为3组：A组为假手术组，B组为单纯缺血再灌注组，C组为克罗卡林干预组，每组24只分6h、24h、72h、7d，4个时间点，每个时间点各6只。
　　 2．动物模型制备：应用改良Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠苏醒后参照Zea Longa5分制标准【3】进行神经行为学评分：1-3分动物入选，，0、4分动物、开颅后发现脑蛛网膜下腔出血动物及再灌注后24小时之内死亡的动物弃之不用，随机等量补齐按原方案重新造模进行。
　　 3．动物处理：C组在MCAO后2h给予克罗卡林(0.4mg/kg/d)2ml腹腔注射。B组在MCAO后2h给予生理盐水2ml腹腔注射。A组除了不插入线栓其他同B组。达到各时间点后，用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用生理盐水和4％多聚甲醛进行心脏灌注固定，取脑，制作脑部冠状石蜡切片(厚度4μm)。
　　 4．观察指标：达各时间点大鼠处死前进行神经功能缺损评分。采用免疫组化染色（SP法）检测CA1区OX42（小胶质细胞的标志）、iNOS的表达变化情况。各组取7d时间点进行海马CA1区神经元尼氏染色，每组取6张切片，在400倍视野下计数神经元。
　　 5．统计学方法：实验数据采用均数±标准差（x士s）表示，应用SPSS10.0统计软件分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析( one-way, ANOVA)，均数间的两两比较采用LSD检验，以α=0.05作为显著性检验水准。
　　 结果:
　　 1．动物神经行为评分：A组大鼠清醒后无明显神经功能缺损症状，B、C组大鼠在造模后再灌注6h清醒状态下神经功能缺损评分差异不明显（P＞0.05）。在其他时间点B组与C组神经功能缺损相比，C组神经功能缺损较B组显著减轻（P＜0.05）。
　　 2．免疫组化染色海马CA1区OX42的表达情况：A组、B组、C组各个时间点海马CA1区OX42均有表达，A组4个时间点OX42表达变化不明显，B、C两组6小时开始表达，24小时明显增多，72小时达高峰，7天仍有表达，明显高于A组各时间点(P＜0.05)；C组各时间点OX42表达均少于B组(P＜0.05)。
　　 3．免疫组化染色海马CA1区iNOS的表达情况：A组、B组、C组各个时间点海马CA1区iNOS均有表达；A组4个时间点iNOS表达变化不明显；B、C两组6小时开始表达，24小时明显增多，72小时达高峰，7天仍有表达，明显高于A组各时间点(P＜0.05)；C组时间点iNOS表达均少于B组(P＜0.05)。
　　 4．神经元尼氏染色：A组神经元60.66±6.62个，B组神经元11.50±3.08个，C组神经元29.33±4.88个，三组之间差异明显，有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1．急性脑缺血再灌注损伤后可引起大鼠海马CA1区小胶质细胞激活，诱导性一氧化氮合酶表达增多，并随着再灌注时间延长增强，对脑组织产生损害作用。
　　 2．克罗卡林可抑制海马CA1区小胶质细胞激活，抑制诱导性一氧化氮合酶表达，减少缺血再灌注对脑组织的损害作用。
　　 3．克罗卡林可保护海马CA1区神经元，减少神经元的死亡，减轻神经缺损症状，具有脑保护作用。

目录

文摘

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中英文缩语对照表

克罗卡林对急性脑缺血再灌注大鼠MG、iNOS的影响

前言

材料和方法

统计学处理

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 急性脑缺血再灌注损伤与K-ATP通道开放剂的脑保护

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