人源尘肺病噬菌体单链抗体库的构建和初步鉴定

摘要

研究背景：
　　 尘肺病目前仍是中国职业病中发病率最高、死亡危险性较大、对劳动者危害最严重的一类,迄今尚无将其消除或逆转的根治方法,只能根据病情进行综合医治以减轻症状、延缓病情进展,因此,积极预防并尽早诊断对于增进病人生存质量及延长寿命尤为重要。迄今为止,国内外已经对尘肺病进行了大量的相关研究,但尘肺病的形成机制目前还不十分清楚,不仅尘肺病所致肺组织纤维化尚无消除或逆转的根治方法,也缺乏接尘人群健康监护、早期预警及尘肺病早期发现的有效生物监测指标,诊断仍然依靠达到一定病理程度后的X线表现。进一步探索尘肺病的发生、发展和演进过程,筛选和鉴定出能够反映粉尘接触、尘肺病进程的生物标志,对解释尘肺病发病分子机制、进行尘肺发病的早期预警和诊断以及研究阻止纤维化进展的干预靶点,都具有积极的意义和作用。
　　 目的：
　　 利用噬菌体抗体库技术,构建人源尘肺病ScFv噬菌体单链抗体库,为尘肺病生物标记筛选打下基础。
　　 方法：
　　 首先分离尘肺病人外周血淋巴细胞,提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,采用兼并引物利用半巢式PCR扩增抗体重链(VH)和轻链可变区(VL)基因。使用带有粘端的Linker将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因。
　　 将ScFv和噬菌粒载体pCANTAB-5E进行双酶切后,将ScFv与pCANTAB-5E进行拼接,转化至感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建了全人源尘肺噬菌体单链抗体库,对抗体库的库容量与多样性进行检测。
　　 结果：
　　 结果显示:琼脂糖电泳从尘肺病人外周血中提取的总RNA,可见明显的28S和18S2条带,提示总RNA无降解且完整性较好；VH片段大小为370bp左右,VL片段为320bp左右,组装后ScFv基因片段(VH—Linke-VL)长度为750bp左右。
　　 涂板后隔夜培养,初步估算抗体库库容量为2.4×107的噬菌体单链抗体库。随机挑取5个单克隆,质粒双酶切后显示阳性插入率100％(5／5)。
　　 结论:成功构建了库容为2.4×107的全人源尘肺病噬菌体单链抗体库,抗体库多样性良好。