hESC和hiPSC体外定向诱导分化的实验研究

摘要

目的：
　　 研究体外诱导人胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和人工诱导的人多能干细胞(Inducible pluripotent stem cells,iPSC)分化为内耳毛细胞及神经细胞祖细胞的方案,并探讨体外诱导分化各个阶段相关基因的表达情况及其意义。
　　 材料和方法：
　　 应用含有抑制剂(DKK1,A8301,DMH)和细胞因子(胰岛素样生长因-1,碱性成纤维细胞生长因子)的培养基,使胚胎干细胞和人工诱导的人多能干细胞先悬浮培养后贴壁培养,并对各个时间点的基因表达量进行实时定量PCR检测,培养第13天进行免疫荧光检测。
　　 结果：
　　 悬浮培养人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞第三天可形成类胚体,随着悬浮培养类胚体变得圆润饱满;贴壁培养并更换培养基,类胚体开始分化形成神经花环。多能性基因nanog和oct4表达量随时间的增长而降低;神经元祖细胞特异性基因pax6和nestin表达量分别在第8天和第10天达到最高后开始减低;毛细胞祖细胞特异性基因otx2,pax2和pax8分别在第4天,第10天和第10天达到最高后开始减低。实验组胚胎干细胞分化的祖细胞特异性基因otx2,nestin,pax6,pax2和pax8表达量与对照组相比有显著性差异(p＜0.05);实验组人工诱导的多能干细胞分化的祖细胞特异性基因otx2,nestin,pax6,pax2和pax8表达量与对照组相比有显著性差异(p＜0.05):胚胎干细胞和诱导的多能干细胞来源的祖细胞可特异性表达抗体PAX6,PAX2和NESTIN。
　　 结论：
　　 1.通过本实验确立了诱导人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞有效分化为毛细胞和神经细胞的祖细胞的实验方案。
　　 2.体外培养时WNT信号抑制剂DKK1,BMPH信号抑制剂DMH1,TGF-β信号抑制剂A8301和细胞因子IGF可以有效的促进人胚胎干细胞和诱导的人多能干细胞分化为毛细胞及神经细胞的祖细胞。
　　 3.在体外诱导人胚胎干细胞和诱导的人多能干细胞分化为毛细胞及神经细胞的祖细胞的过程中特异性基因是相继表达的。