PRRSV ADE感染对猪肺泡巨噬细胞TNF-α及IFN-β转录调控

摘要

猪呼吸与繁殖综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一种以呼吸障碍、怀孕母猪繁殖障碍为特征的一种病毒性疾病,给养猪业造成巨大损失。PRRS的致病因子为猪呼吸与繁殖综合征病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV),属于尼多病毒目动脉炎病毒科。PRRSV对巨噬细胞有专嗜性,不仅可通过天然的病毒受体感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),还可通过Fc受体介导的胞吞作用(ADE)感染PAM,ADE作用是PRRS防控的难题之一。
　　 PAM感染病毒后都可分泌多种细胞因子和抗病毒蛋白,其中IFN-β是机体固有免疫抵御病毒感染的重要一员,TNF-α是重要的炎性因子,并具免疫调节作用;核因子(NF-κB)是信号转导通路中的枢纽,调节TNF-α等多种基因的转录,IRF-1及IRF-3是另一类重要的转录因子,可与NF-κB相互作用,调控IFN的表达。
　　 本研究用PRRSV BJ-4株在体外经ADE途径感染PAM,研究TNF-α、IFN-β、NF-κB、IRF-1及IRF-3的转录动态,探索PRRSV ADE感染对IFN-β及TNF-α的转录调控。
　　 采取新鲜猪肺,分离并培养PAM,提取PAM总RNA经反转录得cDNA,用特异性引物进行PCR扩增,获得了TNF-α、IFN-β、NF-κB、IRF-1、IRF-3及β-actin基因片段,经琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的PCR产物,与PMD19-T载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒,经PCR鉴定和测序,表明成功的克隆了目的基因片段。将重组质粒依次梯度稀释,作为标准品,进行SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR扩增,通过条件优化,成功建立了猪细胞因子TNF-α、IFN-β及相关转录因子NF-κB、IRF-1、IRF-3及β-actin SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测方法。
　　 PRRSV BJ-4经ADE途径感染PAM,以正常感染为对照;感染24h后提取细胞总RNA,利用已建好的荧光定量方法对TNF-α、IFN-β、NF-κB、IRF-1、IRF-3进行检测,结果表明,PRRSV ADE感染PAM TNF-α、IFN-β下调,其相关的转录因子NF-κB、IRF-1、IRF-3转录也被抑制。初步揭示了PRRSV ADE感染所引起的胞内免疫应答的作用的改变,为进一步了解ADE分子机制奠定基础。