L-苯丙氨酸基因工程菌的构建及其发酵条件研究

摘要

苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在医学、食品加工及饲养添加剂领域均有广泛应用,目前国内企业的供应量远不能满足市场口益增长的需求量。因此,应用代谢上程的方法构建L-苯丙氨酸高产菌株,降低生产成本,对减少我国L-苯丙氨酸进口,提高市场竞争力具有重要意义。
　　 选取大肠杆菌L-苯丙氨酸合成路径上的关键酶甘油激酶(glpK基因编码)和3-磷酸甘油脱氢酶(glpD基因编码),PCR克隆glpK与glpD基因后,将它们分别与载体pAF(C)、pZA31连接,得到载体pAF(C)D、pAF(C)K I、p31K;然后分别改变载体pAF(C)K I的启动子序列和基因glpK基因的核糖体结合位点序列(RBS序列)获得载体pAF(L)K与pAF(C)KⅡ。将一个或两个载体转化入E.coll1MG△中,构建工程菌E.coli MG△pAF(C)D、E.coliMG△pAF(C)KⅠ、E.coliMG△pAF(L)KⅠ、E.coliMG△pAF(C)KⅡ、E.coliMG△p31K-pAF(C)、E.coliMG△pAF(C)KⅡ-p31PT,首次实现了基因glpK与pheA和aroF,基因glpD与pheA和aroF,glpK与pheA、aroF、ppsA和tktA的共表达。
　　 将构建的工程菌做SDS-PAGE电泳,glpK和glpD基因在相应工程菌中均有表达,即在蛋白电泳凝胶上预期位置56.231 KD处(glpK)和56.751 KD处(glpD)有表达条带。
　　 工程菌在250 ml的烧瓶中,37℃、240 rpm/min条件下,分别以15 g/L葡萄糖和10 g/L甘油为碳源进行发酵,结果显示,工程菌在以甘油为碳源的培养基中L-苯丙氨酸产量显著高于以葡萄糖为碳源时的产量,菌株E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-Phe产生能力较强。以10 g/L甘油为碳源发酵48 h后,工程菌E.coliMG△pAF(C)KⅡ的L-苯丙氨酸产量达到3.43 g/L,是同条件下对照菌株E.coliMG△pAF(C)产酸量的3.33倍,是空白菌株E.coliMG△L-Phe产量的62.36倍,说明glpK基闪的表达达到了增加终产物L-Phe的目的。
　　 以E.coliMG△pAF(C)KⅡ为研究对象,进一步的发酵条件优化后,结果显示,大肠杆菌最适生长温度37℃条件下,增加发酵时问、增加发酵过程中的通气量有利于工程菌L-Phe的产出:在37℃、240 rpm/min条件下,E.coliMG△pAF(C)KⅡ在500 ml摇瓶中发酵48 h后L-Phe产量达到了3.94 g/L。
　　 本研究构建的E.coliMG△pAF(C)KⅡ菌株,实现了在我们前期工作基础上L-Phe产量的进一步提高,为后续工作中L-Phe高产菌株的构建起到一定的启示作用。