热疗提高人淋巴瘤细胞SU-DHL-6对NK细胞杀伤敏感性的实验研究

摘要

淋巴瘤(lymphoma)是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤,无痛性、进行性淋巴结肿大和(或)局部肿块为其特征性的临床表现,组织学分类以非霍奇金淋巴瘤占多数,且以B细胞性来源淋巴瘤为主。其治疗方案通常采用多药联合化疗、放疗,近年来随着靶向治疗药物利妥昔单抗的问世,造血干细胞移植技术的不断完善、生物免疫学治疗的应用,淋巴瘤的综合治疗效果得到了明显提高,但仍存在复发、难治及耐药淋巴瘤患者,如何改善此类患者的疗效成为许多学者研究的重点。
　　 热疗(Hyperthermia)是继手术、化疗、放疗和生物学免疫治疗之后治疗肿瘤的又一重要手段。热疗能有效杀伤恶性肿瘤细胞,提高肿瘤患者的生存质量,延长病人的生存时间,并且增加患者对放疗和化疗的敏感性,与放疗、化疗产生互补协同作用,同时又减轻放疗、化疗的副作用,因此被医学界称之为“绿色疗法”。此外有研究表明,热疗不仅能够直接杀伤肿瘤细胞,更重要的是热疗可以激发机体免疫系统,间接的清除肿瘤细胞。
　　 自然杀伤细胞(Natural Killer Cells,NKs)作为淋巴细胞的一种,在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用,并且其对肿瘤细胞的杀伤预先无需抗原的刺激和(或)活化即可发挥细胞毒效应,因此近年来一直是国内外研究的热点。NK细胞表面表达有多种不同类型的受体,根据介导的功能效应不同而被区分为活化性受体和抑制性受体,两者同靶细胞表面各自的相应配体结合可以引起NK细胞被激活或抑制,进而发挥细胞毒作用,达到清除肿瘤细胞目的。因此NK细胞杀伤靶细胞的活性高低不仅与其自身抑制性和(或)活化性受体表达水平有关,同时和靶细胞表面相应受体配体的表达水平密切相关。研究表明,多种方法可以诱导NK细胞表面活化性受体的表达,从而提高NK细胞对靶细胞的杀伤活性。因此本研究设想,是否可以通过一定的方法提高靶细胞表面NK细胞活化性受体配体的表达量,进而提高肿瘤靶细胞对NK细胞的杀伤敏感性,促进肿瘤细胞的清除。
　　 目的:
　　 本实验通过对热疗前后人淋巴瘤细胞SU-DHL-6生物学特性的研究,探讨热疗能否改变SU-DHL-6细胞对NK细胞的杀伤敏感性及其可能相关的分子机制是什么,从而为热疗用于淋巴瘤的综合治疗提供理论依据。
　　 研究方法:
　　 第一章人B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-6细胞的生物学特性
　　 常规培养SU-DHL-6细胞,光镜下观察其细胞形态及生长特点;细胞计数法绘制生长曲线并计算倍增时间;流式细胞仪分析SU-DHL-6细胞的免疫表型及细胞周期分布;MTT法分析其耐药谱。
　　 第二章热疗对SU-DHL-6细胞的体外抑制作用
　　 MTT法分析不同温度(40、42、43°)热疗对SU-DHL-6的生长抑制率;光镜下观察热疗后SU-DHL-6细胞的形态变化;流式细胞仪分析热疗后SU-DHL-6细胞的细胞周期分布及细胞凋亡情况;ELISA法分析热疗后SU-DHL-6细胞HSP70蛋白水平的表达情况;
　　 第三章热疗前后SU-DHL-6细胞对NK细胞的体外杀伤敏感性
　　 取3例正常人外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选得高纯度NK细胞作为效应细胞,以热疗前后SU-DHL-6细胞作为靶细胞,采用CFSE/PI双染法,用流式细胞仪检测效靶比为20:1时热疗前后SU-DHL-6细胞对NK细胞的体外杀伤敏感性。
　　 第四章热疗提高SU-DHL-6细胞对NK细胞杀伤敏感性机制的初步探讨
　　 RT-PCR检测热疗前、42℃热疗60min后继续常规培养48h后SU-DHL-6细胞NKG2D配体基因及hsp70基因的表达情况。
　　 结果:
　　 1.人淋巴瘤SU-DHL-6细胞呈圆形,透光性好,体积大,单个或成团悬浮生长,细胞群体倍增时间为23.12h。SU-DHL-6细胞为B淋巴细胞,高表达B细胞表面标志;细胞周期为:G0/G1期细胞占33.8％,S期细胞占61.4%、G2/M期细胞占4.85%。不同化疗药物在不同作用浓度下对SU-DHL-6细胞的生长抑制作用有差异,均呈浓度依赖性。
　　 2.随着温度的升高,热疗对SU-DHL-6细胞的生长抑制作用逐渐增强;光镜下观察热疗后SU-DHL-6细胞包浆中颗粒增加,薄膜膜完整,但光滑性欠佳;热疗后细胞周期分布情况:G0/G1期细胞占25.1%,S期细胞占48.1%、G2/M期细胞占26.9%;热疗后细胞凋亡率为34.4%。热疗后HSP70表达量增加,随着培养时间的延长,又逐渐恢复正常,在热疗后48小时表达水平最高。
　　 3.效靶比为20:1时,热疗干预后的SU-DHL-6细胞对NK细胞的杀伤敏感性高于热疗前。
　　 4.热疗干预后,HSP70及NKG2D配体基因(ULBP2除外)的表达量上调。
　　 结论:
　　 1.热疗能够抑制SU-DHL-6细胞的生长,促进细胞凋亡,改变细胞周期分布,G0/G1期、S期细胞减少,相对增加G2/M期细胞的比例。
　　 2.热疗可以提高SU-DHL-6细胞对NK细胞杀伤敏感性,其机制可能是①热疗提高了HSP70的表达量,参与调节NK细胞的活化。②热疗上调了SU-DHL-6细胞表面活化性受体NKG2D相应配体基因的表达有关。