低磷胁迫下甘蓝型油菜幼苗蛋白双向电泳及图谱分析

摘要

油菜是中国最重要的油料经济作物之一,土壤有效磷缺乏严重影响油菜的产量和品质。人们通过大量施用磷肥来提高油菜的产量,然而我国的磷矿储存量有限,而且磷肥的大量施用会污染环境,因此对植物暨油菜响应低磷胁迫的分析有助于解析植物对磷营养的吸收和利用,为作物的抗逆机理及遗传育种研究打下理论基础。
　　 本研究首先建立油菜幼苗营养液水培的方法,在此基础上以甘蓝型油菜(中油821)为材料,结合前期研究基础,对低磷胁迫下油菜幼苗形态、相关生理特征进行分析;建立了基于管状胶的油菜蛋白双向电泳技术体系,得到了低磷胁迫下幼苗叶片、根系蛋白差异表达图谱并进行分析,为本实验室后续开展的油菜幼苗响应低磷胁迫的分子机理研究奠定基础。主要研究结果如下:
　　 1、优化了油菜幼苗低磷胁迫的水溶液培养方法。结合后续实验要求和低磷营养液处理剂量、培养时间、培养步骤等因素,采取预培养环节并降低营养液浓度至四分之一,确定了适合于低磷胁迫的油菜幼苗水溶液培养方法。
　　 2、考察了低磷胁迫下油菜幼苗的形态学指标。低磷胁迫下,油菜幼苗外部形态与对照比有明显变化。地上部分真叶叶片较小、颜色暗绿;根系变细,低磷胁迫下幼苗根系长度显著高于对照(处理后14天达到对照的122％)。
　　 3、低磷胁迫下油菜幼苗根系相关生理学分析表明:低磷胁迫促进了油菜幼苗根系活力,低磷胁迫处理期间,油菜幼苗根系活力均有不同程度的提高,21天时为对照的127%;低磷胁迫诱导根系分泌磷酸酶,酸性磷酸酶活显著高于对照,在低磷胁迫21天后为对照的187%;低磷胁迫在一定范围内提高保护酶活性,低磷胁迫下过氧化物酶和过氧化氢酶活性均有不同程度的升高,14天后达到最大值,分别为对照的205%和190%。
　　 4、建立和优化了基于管状胶的油菜幼苗双向电泳体系(two-dimensional gelelectrophoresis,2D-PAGE)。采用三氯醋酸-丙酮法提取总蛋白;选取7M尿素裂解液裂解(含7M尿素,4%Chaps,2M硫脲)蛋白干粉;确定叶片和根系蛋白的最佳上样量分别为400μg和260μg。
　　 5、利用上述适合幼苗生长的水培方法和优化的双向电泳技术体系,对低磷胁迫处理的油菜幼苗根系、叶片蛋白双向电泳分析,获得了蛋白丰度、解析度较高的差异蛋白表达图谱。图像解析表明:差异蛋白稳定表达,图谱重复性较好,叶片和根系的相关系数分别为0.86和0.72;低磷胁迫下叶片中稳定上调表达的差异点为11个,下调表达的为11个;低磷胁迫下根系中稳定上调表达的蛋白点为25个,下调表达的为37个。
　　 6、分析了低磷胁迫对油菜幼苗生长和生理影响的相关机理;探讨了有关自制管状胶双向凝胶电泳及蛋白图谱分析中存在的问题,为后续的实验奠定了良好的基础。