Ⅰ型酷氨酸血症模型小鼠酒精性肝损伤敏感性研究

摘要

酒精性肝损伤严重影响着人体健康,其发病机制需进一步研究,Ⅰ型酪氨酸血症模型小鼠对酒精敏感性的研究至今未见报道。
　　 目的：
　　 利用延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fuarylacetoacetate Hydrolase,Fah)基因敲除小鼠建立酒精性肝损伤模型,探讨其发生机制,为防治酒精性肝损伤提供依据。
　　 材料与方法：
　　 对129小鼠交配繁殖的子代进行基因鉴定,得到雄性Fah基因敲除(Fah-/-)和野生型(Fah+/+)小鼠各20只。两种小鼠各随机分为对照组和酒精性肝损伤模型组,每组10只,共4组。根据Liber-Decarli模型建立小鼠酒精性肝损伤模型,对照组给予无酒精液体饲料。3周后取血,检测血清丙氨酸转移酶(Alanineaminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST),甘油三酯(Triglyceride,TG)。处死小鼠,称取肝重,计算肝脏指数,制备10％肝匀浆,检测丙二醛(Malonaldehyde,MDA),超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD),谷胱甘肽(Glutathione,GSH)。肝脏固定后,做石蜡切片,HE染色观察肝损伤程度,TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况。提取组织mRNA和蛋白,运用Real-time PCR技术检测TNF-α,IL-6,TGF-β,Caspase-8,Bax,Bcl-2 mRNA表达水平;应用Western-blot技术检测凋亡因子Caspase-8,Bax,Bcl-2的蛋白表达水平。
　　 使用SPSS11.5软件对数据进行统计学分析,计量资料用(x-±S)表示,统计分析采用重复测量方差分析和单因素方差分析,以α=0.05作为检验水准。
　　 结果：
　　 1小鼠体重和肝脏指数变化:两对照组小鼠体重上升,两模型组小鼠体重下降(P＜0.05)。与各对照组相比,两模型组肝脏指数增大(P＜0.05);Fah-/-模型组肝脏指数显著性高于Fah+/+模型组(P＜0.05)。
　　 2小鼠血清生化指标和肝脏脂肪的变化:两对照组血清ALT、AST、TG和肝脏TG水平差异无统计学意义(P＞0.05);两模型组ALT、AST、TG和肝脏TG水平均高于其对照组(P＜0.05):Fah-/-模型组ALT、AST、TG和肝脏TG水平均高于Fah+/+模型组(P＜0.05)。
　　 3小鼠肝脏氧化和抗氧化水平变化:两对照组肝脏MDA、GSH和SOD差异无统计学意义(P＞0.05);两模型组肝脏MDA水平均高于其对照组(P＜0.05),GSH、SOD水平均低于其对照组(P＜0.05):Fah-/-模型组肝脏MDA水平高于Fah+/+模型组(P＜0.05),SOD水平低于Fah+/+模型组(P＜0.05);两模型组肝脏GSH水平差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4肝脏病理学变化:与对照组相比,两模型组肝脏体积增大,色泽灰暗,肝脏正常组织结构消失,肝细胞索排列紊乱,胞浆疏松,胞质内可见脂肪空泡和气球样变性。与Fah+/+模型组相比,Fah-/-模型组肝损伤较严重。
　　 5相关基因mRNA和蛋白表达情况:两对照组的TNF-α,IL-6,TGF-β,Caspase-8,Bax,Bcl-2 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),两模型组的TNF-α、IL-6mRNA水平均高于其对照组(P＜0.05),Bcl-2 mRNA水平低于其对照组(P＜0.05);Fah-/-模型组的YNF-α、IL-6和Caspase-8 mRNA水平高于Fah+/+模型组(P＜0.05),Bcl-2 mRNA水平低于Fah+/+模型组(P＜0.05),两模型组TGF-β和Bax mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05)。Western-blot结果显示,两模型组的Caspase-8、Bax蛋白水平明显上调,Bcl-2蛋白水平明显下调:Fah-/-模型组的Caspase-8、Bax蛋白水平高于Fah+/+模型组,Bcl-2蛋白水平低于Fah+/+模型组。
　　 6细胞凋亡情况:Tunel染色结果显示,Fah-/-模型组肝脏细胞凋亡较Fah+/+模型组严重。
　　 结论：
　　 对小鼠持续饲喂含酒精的液体饲料可成功制备慢性酒精性肝损伤模型:Fah基因敲除可加重小鼠酒精性肝损伤;酒精性肝损伤与氧化应激、炎症反应和肝细胞凋亡有关。