三氧化二砷恢复雌激素受体α阴性乳腺癌细胞对内分泌治疗敏感性的研究

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且发病率不断上升，严重危害广大妇女的健康。在过去我国属于乳腺癌的低发国家，但随着人们生活水平的提高和生活方式的西化，近年来的发病率亦呈明显上升趋势，10年来乳腺癌的发病率增加了47％，达到了25/10万，乳腺癌在城市女性中的发病率位于恶性肿瘤第2位，调查数据显示，在中国的北京、上海、广州、深圳四大城市，乳腺癌的发病率已经上升至第1位，乳腺癌已经成为我国女性生命健康的一个重大威胁。
　　 所有乳腺癌患者中30％～40％为雌激素受体α(Estrogen Receptorα，ERα)阴性乳腺癌，与ERα阳性乳腺癌患者相比较，其组织分化差，恶性程度较高，术后短时间内较易出现复发和转移，且对内分泌治疗药物如他莫昔芬(三苯氧胺，TAM)不敏感，目前除化疗外尚无其他有效治疗办法。近期研究表明，ERα基因缺失、突变等遗传改变的发生率较低，推测其表达缺失与启动子区CpG岛异常高甲基化有关。因此，如果能够恢复ERα阴性乳腺癌患者的ERα基因表达并探讨恢复表达后的药物治疗方法，对于ERα阴性乳腺癌患者的临床治疗来说具有重大意义。
　　 三氧化二砷(As2O3)是中药“砒霜”中的主要成分，早在2500多年前，中国古代就有应用“砒霜”等砷类物质治疗包括恶性肿瘤在内的多种疾病的记载。在1972年，哈尔滨医科大学最早发现“砒霜”的主要成分-亚砷酸（即As2O3），对急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗显示出极好的疗效。近年来有报道As2O3可通过竞争利用S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)，直接和间接抑制DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase)等途径发挥了去甲基化的功能，因此As2O3有可能作为去甲基化剂恢复ERα阴性乳腺癌患者ERα的表达，从而使其重新获得内分泌治疗的机会。有关As2O3治疗恶性肿瘤的文献很多，但治疗乳腺癌的文献为数不多，其中通过去甲基化恢复ERα表达并联用三苯氧胺(TAM)治疗ERα阴性乳腺癌的体内外研究国内外除本实验室外尚未见报道。
　　 第一部分：正常乳腺组织和乳腺癌组织中DNMT1和ERα的表达与ERα甲基化状态的关系及临床病理学意义
　　 材料与方法：
　　 1.免疫组织化学法和RT-PCR联合检测20例正常乳腺组织和112例乳腺癌组织中DNMT1和ERα蛋白及mRNA的表达情况;
　　 2.MS-PCR检测正常乳腺组织、ERα阳性乳腺癌组织、ERα阴性乳腺癌组织中ERα基因启动子的甲基化状态;
　　 3.统计学处理:所有数据应用SPSS17.0软件进行处理，以均数±标准差((x)±s)表示，两分类变量的比较用Pearson'sx2检验;两个有序变量之间的相关性检验用Spearman等级相关分析，以α=0.05为显著性检验水准。
　　 结果：
　　 1.免疫组织化学法和RT-PCR联合检测结果显示:正常乳腺组织及ERα阳性乳腺癌组织中DNMT1的蛋白及mRNA阳性表达率较低，分别为10.00％、46.05％和15.00％、48.68％;而在ERα阴性乳腺癌组织中表达较高，为81.11％和88.89％，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.MS-PCR检测结果显示:正常乳腺组织、ERα阳性乳腺癌组织、ERα阴性乳腺癌组织中ERα启动子甲基化阳性率分别为10.00％、36.84％和86.11％，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.在乳腺癌组织中，ERα蛋白表达与患者年龄、是否绝经、病灶大小、淋巴结转移情况、临床分级及病理类型比较均未见相关性（P＞0.05），与PR表达情况相关(P＜0.05)。DNMT1蛋白表达与患者年龄、是否绝经、病灶大小、淋巴结转移情况、临床分级及病理类型比较均未见明显相关性(P＞0.05);经Spearman等级相关分析DNMT1的表达和ERα的表达呈负相关关系(P＜0.05);DNMT1的表达和ERα启动子的甲基化率呈正相关关系(P＜0.05)。
　　 第二部分：三氧化二砷(As2O3)对ERα阴性人乳腺癌细胞
　　 MDA-MB-435s的去甲基化作用及对增殖的影响
　　 材料与方法：
　　 1.MS-PCR及甲基化测序检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435sERα基因甲基化状态的变化;
　　 2.RT-PCR检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435sDNMT1及ERαmRNA相对表达水平的变化;
　　 3.免疫组织化学及Westernbolt检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435sDNMT1和ERα蛋白表达水平的变化;
　　 4.MTT法检测不同浓度As2O3处理后联用TAM对ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响;
　　 5.统计学处理:所有数据应用SPSS17.0软件进行分析，结果以均数±标准差((x)±s)表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析法(One-wayANOVA)，以α=0.05为显著性检验水准。
　　 结果：
　　 1.MS-PCR结果显示:经As2O3处理后ERα基因出现不同程度的去甲基化条带，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。甲基化测序显示部分未甲基化的C变为T。
　　 2.RT-PCR、免疫组织化学及Westernbolt结果显示:经As2O3处理后DNMT1表达受到抑制，而ERα则逐渐恢复表达，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性，与对照组相比P＜0.05，其差异具有统计学意义。
　　 3.不同浓度As2O3作用24h、48h时，各组细胞增殖均明显受到抑制，抑制率随着剂量的增加而升高，尤以加TAM后抑制更加明显(P＜0.05)。
　　 第三部分：三氧化二砷(As2O3)和三苯氧胺联用对MDA-MB-435s
　　 细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响
　　 材料与方法：
　　 1.建立裸鼠移植瘤模型，比较各用药组裸鼠瘤体终重量及终体积的差异;
　　 2.MS-PCR及甲基化测序检测各用药组ERα基因甲基化状态的变化;
　　 3.RT-PCR、免疫组化及Westernbolt检测DNMT1及ERαmRNA及蛋白表达水平的变化;
　　 4.统计学处理:所有数据应用SPSS17.0软件进行处理，以均数±标准差((x)±s)表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析法(One-wayANOVA)，以α=0.05为显著性检验水准。
　　 结果：
　　 1.各As2O3用药组的瘤体终重量和终体积均明显降低，且As2O3联用TAM后抑制作用更强，与TAM单用组及生理盐水组相比其差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.MS-PCR结果示各As2O3单用及联用TAM组瘤组织呈现不同程度的去甲基化条带，而TAM单用组及生理盐水组未见明显去甲基化条带。甲基化测序显示部分未甲基化的C变为T。
　　 3.RT-PCR、免疫组织化学法及Westernblot结果示各用药组随着As2O3剂量增加瘤组织中DNMT1蛋白表达逐渐受到抑制，而ERα则逐渐恢复表达，而生理盐水组及TAM单用组未见明显变化。各As2O3单用及联用组与生理盐水组及TAM单用组相比其差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.在乳腺癌组织中，DNMT1的表达和ERα的表达呈负相关关系;DNMT1的表达和ERα的甲基化率呈正相关关系。
　　 2.三氧化二砷可以抑制DNMT1活性使ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435sERα去甲基化恢复表达;
　　 3.恢复的ERα使MDA-MB-435s细胞具有对内分泌治疗的敏感性。这有可能为临床中ERα阴性乳腺癌患者的治疗提供一条新的途径。

目录

声明

摘要

英文缩略词及中英文对照索引

引言

第一部分 正常乳腺组织和乳腺癌组织中DNMT1和ERα的表达与ERα甲基化状态的关系及临床病理学意义

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 免疫组化结果

2．2 RT-PCR结果

2．3 MS-PCR结果

3 讨论

参考文献

小结

第二部分 三氧化二砷(As2O3)对ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s的去甲基化作用及对增殖的影响

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 正常细胞形态

2．2 As2O3诱导ERα DNA去甲基化的作用

2．3 As2O3处理前后MDA-MB-435s细胞DNMT1和ERα mRNA表达变化

2．4 免疫组化检测As2O3对MDA-MB-435s细胞DNMT1和ERα蛋白表达的影响

2．5 Western bolt检测As2O3对MDA-MB-435s细胞DNMT1和ERα蛋白表达的影响

2．6 MTT法检测As2O3单用及联用对MDA-MB-435s细胞增殖的抑制作用

3 讨论

参考文献

小结

第三部分 三氧化二砷(As2O3)和三苯氧胺联用对MDA-MB-435s细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响

前言

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 人乳腺癌MDA-MB-435s细胞异种移植瘤动物模型的建立

2．2 6组裸鼠移植瘤的组织学观察

2．3 As2O3单用及联用TAM后对裸鼠移植瘤的抑制作用

2．4 MS-PCR及DNA甲基化测序结果

2．5 各组裸鼠移植瘤中DNMT1和ERα mRNA的表达情况

2．6 免疫组织化学法检测各组裸鼠肿瘤组织中ERα蛋白的表达

2．7 Western blot检测6组裸鼠移植癌组织中DNMT1和ERα蛋白的表达

3 讨论

参考文献

小结

结论

综述

个人简历及博士研究生期间发表的论文

致谢