苯巴比妥对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护及对脑组织中KCC2的影响

摘要

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是指围生期窒息所致缺氧缺血而出现的一系列临床脑病表现，是新生儿窒息后的严重并发症，常可引起不可逆的脑组织损伤和一系列中枢神经系统后遗症。尽管关于HIBD发病机制的学说众多，但是至今尚未予以完全阐明。
　　 目的:本实验旨在研究苯巴比妥干预对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护及对脑组织中KCC2的影响，并对苯巴比妥的脑损伤保护作用机制进行初步探讨。
　　 方法:7日龄SD大鼠，随机分成三组:假手术组、HIBD模型组、苯巴比妥组。HIBD模型组和苯巴比妥组参照Rice-Vannucci方法制作新生大鼠HIBD模型(结扎左颈总动脉后，置于缺氧箱中通入8％氧氮混合气体2h)，假手术组仅游离左颈总动脉，不作缺氧缺血处理。缺氧缺血结束后苯巴比妥组即刻给予腹腔注射苯巴比妥负荷剂量25mg/kg，18h后给予剂量15mg/kg，2次/天，共3天。HIBD模型组给予等体积生理盐水。采用氯化2，3，5-三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC))染色方法检测脑组织梗死体积;通过自主活动及Morris水迷宫等实验观察苯巴比妥对HIBD新生大鼠脑组织是否具有长期保护效应;此外，分别通过采用Real-time PCR、Western-blot及免疫组织化学技术检测KCC2 mRNA、KCC2蛋白水平的表达情况。
　　 结果:
　　 (1)缺氧缺血实验结束2小时后，新生大鼠出现固定向左侧旋转的症状，是模型成功的行为学标志。
　　 (2) TTC染色结果也显示，缺氧缺血模型组动物脑组织有明显的梗死区域，再次验证了我们制备的缺氧缺血模型是成功的。与缺血对照组比较，苯巴比妥干预处理的缺氧缺血新生大鼠脑梗死体积比率明显低于HIBD模型组(p＜0.01)。
　　 (3)自主活动结果显示: HIBD组新生大鼠自主活动较Sham组显著减少，苯巴比妥治疗组与Sham组比较自主运动次数无显著差异(p＞0.05）。
　　 (4) Morris水迷宫实验结果显示:对于平均逃逸潜伏期，HIBD组＞苯巴比妥治疗组＞假手术组，实验组之间的差异有显著性(P＜0.05);HIBD组在目标象限停留的时间百分比和穿越平台次数与苯巴比妥组、假手术组之间均有显著性差异(P＜0.05)。提示HIBD大鼠的学习记忆能力下降，苯巴比妥干预能明显增加HIBD大鼠的学习记忆能力(P＜0.05)
　　 (5)与假手术组比较，KCC2 mRNA及蛋白在缺氧缺血后显著下调，且KCC2蛋白表达降低明显出现在海马CA1区锥体神经元;苯巴比妥组与HIBD组相比，KCC2 mRNA及蛋白表达的下调有所减少，差异非常显著(p＜0.01)。
　　 结论:
　　 (1)苯巴比妥能降低脑组织缺血侧梗死体积比率、增加HIBD大鼠的自主活动能力和空间学习记忆能力，表明苯巴比妥能减轻HIBD病理生理损伤过程，减轻新生大鼠HIBD早期和远期病理改变，从而对HIBD损伤有保护作用。
　　 (2)缺氧缺血后，新生大鼠脑内KCC2 mRNA及蛋白表达下调，苯巴比妥作用后有所上调。
　　 综上所述，苯巴比妥对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤有保护作用，其机制可能与其防止KCC2蛋白表达下降有关。

目录

声明

论文说明

摘要

缩写词对照表

引言

第一部分 苯巴比妥对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 药品

1．3 试剂

1．4 仪器及耗材

1．5 主要试剂配制

2 实验方法

2．1 新生大鼠HIBD模型制作

2．2 动物分组及给药

2．3 观察缺氧缺血对新生大鼠行为学的影响

2．4 TTC染色检测脑组织梗死面积

2．5 自主活动的测定

2．6 学习记忆功能的测评—Morris水迷宫实验

2．7 统计学处理

3 结果

3．1 缺氧缺血对新生大鼠行为学影响的观察结果

3．2 TTC染色检测脑组织梗死体积比率结果

3．3 自主活动的测定结果

3．4 Morris水迷宫实验测试结果

4 讨论

5 小结

第二部分 苯巴比妥对HIBD新生大鼠脑组织中KCC2表达的影响

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 药品

1．3 试剂

1．4 仪器及设备

1．5 常用液体试剂的配制

2 实验方法

2．1 新生大鼠HIBD模型制作

2．2 组织样本的制备

2．3 Real-time PCR检测KCC2 mRNA的表达

2．4 蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测KCC2蛋白的表达

2．5 免疫组织化学实验

2．6 统计学处理

3 结果

3．1 Real-time PCR检测KCC2 mRNA表达的结果

3．2 Western blotting检测KCC2蛋白的表达结果

3．3 免疫组织化学

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

综述 探讨新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制与治疗

个人简历 攻硕期间发表论文

致谢