非小细胞肺癌患者外周血中CD4+Foxp3+调节性T细胞各亚群特性及临床意义

摘要

背景和目的：
　　肺癌是全世界癌症相关死亡的首要原因，严重威胁着人类的生命质量和健康水平。其中非小细胞肺癌约占80％。虽然近年来治疗方法有所提高，但肺癌患者总体5年生存率仍不理想。由于其发病率高，治疗效果有限，五年生存率低，因此人们迫切需要寻找新的治疗方式。近年来研究发现肺癌的发生是一个多因素、多基因相互作用的过程。随着分子生物学技术的不断发展，免疫系统在癌症发生、发展过程中所起的作用越来越被人们所重视。有研究提示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态，肿瘤只有在逃逸机体的免疫机制之后才能得以继续进展。调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)作为一类具有独特免疫调节功能的细胞亚群在肿瘤的免疫逃逸过程中发挥着重要作用。
　　到目前为止已有多种Treg表面标记物被报道，如叉头状/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)，CD127，CD39，Toll样受体，细胞程序性死亡分子(PD-1)，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)等，其中最具特异性的标志是Foxp3。然而近年来有研究表明，人类CD4+Foxp3+T细胞亚群为非均一性细胞群，即有些细胞虽表达Foxp3但不具有免疫抑制功能。Miyara研究组采用CD4、CD25、CD45RA和Foxp3作为表型标志，将人CD4+Foxp3+T细胞分成rTreg、non-Treg、aTreg三群具有不同表型和功能的亚群。目前已在多种肿瘤中发现Treg的异常聚集，并发现Treg水平与部分肿瘤患者的预后有关，但关于rTreg、non-Treg、aTreg与非小细胞肺癌关系的研究还相当匮乏。因此本实验中，我们参考Miyara研究组中定义Treg的标志，分析非小细胞肺癌患者和健康对照组外周血中这三群Treg细胞间的差异，以及与临床参数之间的相关性和化疗前后的变化，并进一步分析验证其特性，从而了解哪群Treg在肺癌患者的免疫抑制中发挥主要作用，以期为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的靶点。
　　方法：
　　采集非小细胞肺癌患者化疗前后及健康人外周血6ml，通过密度梯度离心法获得单个核细胞，采用流式细胞术分析外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg、rTreg、non-Treg、aTreg水平及rTreg、non-Treg、aTreg三群表面抑制性分子CD39，细胞因子IFN-γ、TGF-β分泌情况;并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析非小细胞肺癌患者及健康对照组血浆中TGF-β1水平。
　　结果：
　　1.non-Treg表面表达较低水平的抑制性分子CD39并分泌较高水平的IFN-γ及较低水平的TGF-β;rTreg、aTreg可表达较高水平的CD39，并分泌少量IFN-γ及较高水平的TGF-β。
　　2.与健康对照组相比，非小细胞肺癌组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及其相关细胞因子TGF-β1显著增高（p＜0.01）。但是通过亚群进一步分析发现:肺癌患者与健康对照组相比三群Treg中仅aTreg水平明显增高，差异具有统计学意义(p=0.001)，而rTreg及non-Treg在两组中无明显差异。
　　3.肺腺癌与鳞癌患者之间CD4+Foxp3+T细胞各亚群之间无差异;Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg及aTreg比例明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者。
　　4.非小细胞肺癌患者接受有效的化疗后，外周血中三群Treg水平均降低，其中non-Treg下降明显，具有统计学意义(p=0.024);rTreg及aTreg有下降趋势，但无统计学意义(p值分别为0.063，0.23)。
　　结论：
　　1.CD4+Foxp3+T细胞亚群为非均一性细胞群。
　　2.非小细胞肺癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg水平及相关细胞因子TGF-β1水平显著增高，提示非小细胞肺癌患者处于免疫抑制状态。
　　3.非小细胞肺癌患者外周血中CD4+Foxp3+T细胞各亚群与病理类型无关，CD4+CD25+Foxp3+Treg及aTreg随TNM分期增高而增高。
　　4.有效的化疗可减少非小细胞肺癌体内Treg水平，提高机体的抗肿瘤免疫的功能;调节性T细胞可能是一种潜在的有效的评价肺癌患者疗效的指标，且有可能成为肺癌治疗的新的靶点。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

材料与方法

1 主要试剂

2 主要试剂的配制

3 主要仪器

4 研究对象

5 外周血的收集

6 化疗疗效评价

7 外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的提取

8 PBMC中CD4+FOXP3+亚群的比例及各亚群表面抑制性分子CD39表达的检测

9 PBMC中CD4+Foxp3+T细胞亚群细胞内因子(IFN-γ、TGF-β)分泌水平检测

10 ELISA检测血浆中细胞因子(TGF-β1)水平

11 统计学分析

结果

1 肺癌患者及健康对照组中CD4+FOXP3+Treg亚群比例

2 CD4+FOXP3+Treg亚群与非小细胞肺癌分期及病理类型的关系

3 非小细胞肺癌患者及健康对照组血浆中Treg细胞相关细胞因子TGF-β1水平

4 CD4+Foxp3+mg各亚群表面抑制性分子CD39的表达情况

5 CD4+Foxp3+mg各亚群细胞因子(IFN-γ、TGF-β)分泌水平

6 肺癌患者化疗前后CD4+Foxp3+Treg各亚群变化情况

讨论

结论

参考文献

综述 调节性T细胞在肺癌发生发展中的作用及研究进展

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢