杜氏盐藻FLA8在鞭毛中的定位及其对食管鳞癌细胞的作用

摘要

鞭毛/纤毛是细胞表面突起的亚细胞结构，主要由微管组成，它们在物种的进化过程中非常保守，从原生生物到脊椎动物细胞几乎都存在。由于纤毛与鞭毛在结构和组装机制上基本一致，所以认为它们是存在于不同类型细胞中的同一种细胞器。鞭毛/纤毛不仅在细胞的运动过程中发挥作用，而且还在细胞信号传导中行使一定的功能。比如，参与PDGF[1]、Hedgehog[2,3]、以及Wnt[4，5，6]等信号通路的多种关键因子都定位于纤毛上。纤毛还具有调控细胞分裂的作用，它通过自身的解聚来促成中心体形成纺锤体，并有利于中心粒的自由运动，从而保证纺锤体的取向以及细胞极性[7]，使细胞完成正常的分裂活动。研究表明纤毛的结构或功能异常会造成多种相关疾病，如多囊肾[8]、Kartagener综合征、癌症等。杜氏盐藻是一种能够在高盐环境中繁殖生长的真核藻类，它具有一对等长的鞭毛，长约13μm，鞭毛具有典型的“9+2”结构[9]。由于其鞭毛相对较长，容易观察和分析，且在实验条件下可以去除并再生。因此，杜氏盐藻常作为研究鞭毛/纤毛长度调控及功能的模式生物。
　　 食管癌是我国发病率和致死率最高的癌症之一，尤其以河南林州为重。目前关于食管癌的治疗手段主要为手术治疗、化疗、放疗以及生物治疗相结合的方法，虽然在食管癌的诊断和治疗上取得了一定的进步，但患者的整体治愈率以及预后情况并不乐观。因此寻找新的方法和途径研究食管癌发生发展及恶变的分子机制成为食管癌早期预防和诊断的关键所在。
　　 杜氏盐藻FLA8是Kinesin-2的一个动力亚基，它在鞭毛的组装以及鞭毛内运输过程中发挥重要作用。本实验室先前的研究已经表明杜氏盐藻FLA8参与鞭毛的再生过程，但对于FLA8在杜氏盐藻中的具体定位以及它是否存在于鞭毛上目前还没有研究。在此基础上，本研究首先检测了FLA8在细胞中的分布情况，结果表明其主要定位于细胞核、鞭毛的基底部以及鞭毛上，进一步验证了FLA8在鞭毛长度调控及鞭毛内运输过程中的作用。目前，已有研究证明癌症的发生发展与鞭毛/纤毛的缺陷或异常有关。为了研究杜氏盐藻鞭毛相关基因FLA8对食管鳞癌细胞是否存在影响，我们将已构建好的重组pEGFP-N1-FLA8真核表达载体瞬时转染到食管鳞癌细胞株EC9706和Eca109细胞中，并检测了转染FLA8后细胞的增殖、凋亡、迁移、粘附能力以及细胞形态的变化。结果显示，外源的杜氏盐藻FLA8基因不仅能够成功转染食管鳞癌细胞，并且在细胞中获得了表达。而捕捉到的Eca109不同转染时期的图片则显示，FLA8在细胞的特殊位置有高度聚集的现象，我们推测这些特殊位置是有丝分裂过程中的中心体结构和纺锤体结构，提示FLA8可能参与细胞的有丝分裂过程。但这一推测还需要大量的研究来证实。另外，我们发现转染FLA8后Eca109细胞的增殖能力显著增高，而EC9706、Het-1A细胞的增殖能力却未受到影响。同样令人奇怪的是，FLA8能够增强Eca109细胞的迁移能力，却对EC9706和Het-1A细胞的迁移能力无明显作用。而E-cadherin的表达水平也只在Eca109细胞中受FLA8的影响下调，在另外两株细胞中没有显著的变化。那么为什么FLA8对食管鳞癌细胞的两个细胞株的影响不一致呢？我们推测，这可能与食管鳞癌细胞的分化程度有关系。一般我们认为EC9706细胞是低分化的食管鳞癌细胞，Eca109细胞是高分化的食管鳞癌细胞。只有高分化的Eca109细胞在转染FLA8后受到了影响，表现为增殖和迁移能力增强、粘附性下降等恶变性质。而EC9706细胞未受影响也有可能是在低分化的EC9706细胞中存在某种机制能够抵抗或消除外源蛋白对它的影响以维持自身特性。另外Eca109细胞扫描电镜结果表明，转染后细胞膜的形态发生了明显的变化。最后，我们还检测了FLA8对三株细胞凋亡水平的影响，发现三株细胞转染FLA8后凋亡能力均无明显变化，说明FLA8不参与食管鳞癌细胞的凋亡过程。
　　 材料与方法:
　　 1.藻株、细胞株与载体
　　 杜氏盐藻UTEXLB-1644购自美国德州大学，采用改良型PKS液体培养基于26℃、60μmol光量子·m-2s-1光照强度下培养，光暗周期各为12h。
　　 食管鳞癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，Eca109为本实验室保存，正常食管上皮细胞Het-1A由郑州大学医药科学研究院惠赠。三株细胞均在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中于37℃，5％CO2的条件下培养。
　　 细胞转染所用pEGFP-N1空载体和pEGFP-N1-FLA8重组载体均为本实验室保存。
　　 2.杜氏盐藻FLA8在鞭毛中的定位
　　 采用间接细胞免疫荧光方法检测FLA8在杜氏盐藻中的定位，其中所用一抗为本实验室制备的FLA8兔抗血清，二抗为购买的FITC标记的山羊抗兔IgG。
　　 3.杜氏盐藻FLA8转染食管鳞癌细胞及其表达
　　 根据LipofectamineTM2000和X-tremeGENEHPDNA转染试剂操作说明，将已构建好的pEGFP-N1-FLA8重组载体分别转染食管鳞癌细胞株EC9706、Eca109细胞以及正常食管上皮细胞Het-1A。荧光显微镜下观察转染效果，然后提取细胞总蛋白，热水中煮沸变性后，采用WesternBlot方法鉴定FLA8在三株细胞中的表达情况。
　　 4.杜氏盐藻FLA8对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、粘附及迁移能力的影响
　　 以转染后的三株细胞为研究对象，分别将它们接入96孔板中，待细胞贴壁后，分别采用EdU荧光显微镜法检测细胞增殖能力的变化，TUNEL法检测细胞凋亡水平的变化。另外，通过Transwell小室实验检测细胞的迁移能力、WesternBlot方法检测粘附因子E-cadherin和凋亡蛋白caspase-3的表达量的变化。并应用扫描电子显微镜观察转染后Eca109细胞在形态上的变化。
　　 结果:
　　 1.杜氏盐藻FLA8在鞭毛中的定位
　　 细胞免疫荧光结果显示，在激光共聚焦显微镜下可观察到杜氏盐藻FLA8主要定位于藻体的细胞核、鞭毛基体部以及鞭毛中，提示FLA8可能与鞭毛的再生和组装以及鞭毛内物质运输有关，这与本实验室先前的研究一致。
　　 2.杜氏盐藻FLA8转染食管鳞癌细胞及其表达
　　 转染后的细胞在荧光显微镜下可检测到绿色荧光，并且具有较高的转染效率，表明杜氏盐藻FLA8能够在Eca109、EC9706以及Het-1A细胞中获得表达。采用WesternBlot方法也检测到了FLA8蛋白，进一步证明FLA8在这三株细胞中分别获得了表达。另外，观察转染后不同时期的Eca109细胞发现FLA8蛋白可能在食管鳞癌细胞的中心体样及纺锤体样结构区域存在高表达的现象，推测其可能与细胞的有丝分裂有关。
　　 3.杜氏盐藻FLA8对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、粘附及迁移能力的影响
　　 与对照组相比，FLA8能够增强Eca109细胞的增殖能力和迁移能力(P＜0.05)，但对EC9706、Het-1A细胞却没有明显的作用(P＞0.05)。另外，E-cadherin的表达水平在Eca109细胞中也受FLA8的影响明显下降(P＜0.05)，而在另外两株细胞中没有显著的变化(P＞0.05)。扫描电镜结果显示，Eca109细胞转染FLA8后细胞的形状发生明显的改变，细胞变得圆而立体，细胞核隐晦不可见，膜四周伸出许多“天线”样的触手。以上结果表明，FLA8对高分化的食管鳞癌细胞Eca109存在一定的影响，加强了其恶变的性质。最后，TUNEL检测结果和caspase-3凋亡蛋白表达水平显示，在三株细胞中，细胞的凋亡水平都未受到FLA8的影响而发生改变，提示FLA8不参与细胞凋亡过程。
　　 结论:
　　 1.杜氏盐藻FLA8主要分布于藻体的细胞核、鞭毛基体部及鞭毛上，其真核表达载体能够成功转染EC9706、Eca109细胞和Het-1A细胞，并在三株细胞中瞬时表达。
　　 2.转染后的Eca109细胞形态发生改变，细胞膜周围“触手”样结构增多。
　　 3.杜氏盐藻FLA8能够促进Eca109细胞的增殖能力和迁移能力，降低Eca109细胞中E-cadherin蛋白的表达水平，使细胞的粘附能力下降。

目录

声明

摘要

引言

第一章 杜氏盐藻FLA8蛋白在鞭毛中的定位

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

小结

第二章 杜氏盐藻FLA8在食管鳞癌细胞中的表达

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

小结

第三章 杜氏盐藻FLA8对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、粘附及迁移能力的影响

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

小结

参考文献

综述

致谢

个人简历、硕士研究生期间发表的论文及硕士研究生期间参加的学术会议