酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中与S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白

摘要

目的:应用酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中能与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(dsSAHH)相互作用的蛋白.方法:将构建好的pGBKT7-dsSAHH诱饵载体转化至酵母细胞Y187,与转化有杜氏盐藻cDNA文库的酵母细胞AH109杂交,从杜氏盐藻cDNA文库中筛选出能与dsSAHH相互作用的蛋白质.扩增所得基因片段全长,并在原核内表达该融合蛋白.随后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法验证dsSAHH与目的蛋白在体内、外的相互作用.结果:以dsSAHH为诱饵筛选出3个阳性克隆,扩增得到dsRACK1、dsMetAP1和dseEF1α3个新基因.His pull-down和免疫共沉淀体内外实验证实dsRACK1能与dsSAHH相互作用.结论:dsRACK1是dsSAHH的相互作用蛋白.