肠道病毒柯萨奇B5型巢式RT-PCR检测方法的建立及评价

摘要

目的:
　　 病毒性脑炎（ViralEncephalitis）是儿童时期常见的中枢神经系统感染性疾病，主要临床表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激征等，易造成不同程度的神经系统后遗症，严重威胁儿童身心健康。近年来，河南省发生了多起病毒性脑炎的暴发，经检测主要是由柯萨奇病毒B5(coxsachievirusB5，CVB5)引起。柯萨奇病毒B5是一种常见的能引起病毒性脑炎的肠道病毒，属于肠道病毒属小核糖核酸病毒，无包膜，单股正链RNA，资料显示其引起的病毒性脑炎在我国广泛存在。
　　 病原的分离培养与PCR扩增测序是鉴定CVB5的主要方法和金标准，但由于其缺乏敏感性、检出率低、耗费时间长且费用高，临床上极少采用。聚合酶链式反应(PCR)做为一种新的分子生物学检测技术，具有操作简单、快速、灵敏度和特异度高、易标准化等特点，已被越来越多地应用到肠道病毒诊断上来。但文献中鲜见检测肠道病毒CVB5的PCR方法，所以本文通过建立一种简单、快速、灵敏、特异的检测CVB5的巢式PCR方法，将其与其它肠道病毒，如Echo6、EV71、CVA16等进行鉴别，也为以后CVB5感染的流行病学调查和实验室检测提供了一种更为可靠的手段。
　　 方法:
　　 从GenBank下载河南分离株CVB5全基因序列，用DNAStar软件进行同源性比较，在同源性较高的区域选择出引物设计的模板，根据引物设计原则，用PrimerPremier5.0在VP1区设计了三对巢式PCR引物，并用Blast和Oligo6.0软件对其进行比对和分析评价。最终将这三对巢式PCR引物合成并进行扩增后，通过凝胶成像方法进行验证确定最终选择的引物。提取病毒标准株RNA并反转录为cDNA，以其为模板通过优化PCR反应条件，并对其灵敏度、特异度和重复性进行评价，最终建立了一种快速、简便、准确的检测肠道病毒CVB5的巢式RT-PCR方法。用建立的巢式RT-PCR方法对新采集的212份病毒性脑炎患者样本进行检测，同时与做为金标准的病毒分离检测方法进行比较评价其应用价值。病原的确定通过将PCR反应产物进行克隆测序后，先用DNAStar软件的SeqMan将测定到的核酸序列进行人工辅助校对，再用NCBI软件进行同源性比较，与GenBank公布的序列进行比对分析，核酸序列比对分析利用DNAStar7.0完成。
　　 结果:
　　 1.以病毒标准株反转录得到的cDNA为模板，最终确定两轮扩增反应总体系均为50μl，包括PCR反应液25μl、cDNA模板1μl、上下游引物各1μl、无RNA酶去离子水22μl。在第二轮扩增反应中，取第一轮扩增产物1μl作为模板。反应条件为:94℃3min;94℃，30s，56℃30s，72℃30s，30个循环;72℃10min;4℃，∞。第二轮反应条件除了将第一轮的30个循环改为25个循环外，其他与第一轮相同。
　　 2.方法学评价结果:敏感性:将CVB5标准株选用RD细胞进行病毒效价滴定，然后10倍梯度倍比稀释进行灵敏度实验，成像结果显示第一轮的灵敏度达到10TCID50，第二轮的灵敏度达到10-4TCID50;特异性:将5株不同的CVB5毒株和Echo25、EV71等4株其他肠道病毒毒株及空白对照进行扩增反应后，5株CVB5毒株两轮成像结果均在相应位置出现目的条带，而其他毒株及阴性对照均无目的条带出现，与预期结果一致。重复性:分别用已建立的检测方法将CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性脑炎病例样本用已建立的检测方法重复实验3次，结果均一致。
　　 3.分别用建立的巢式RT-PCR方法和病毒分离方法对212份病毒性脑炎样本进行检测，结果发现经PCR扩增电泳结果为阳性的样本有31份，经测序鉴定全部为CVB5，而病毒培养仅有13份测序结果为阳性。
　　 结论:
　　 本研究建立的巢式RT-PCR检测方法具有简单快速，灵敏度、特异度高，重复性好等特点，有效地解决了病毒分离方法存在的问题，也为以后CVB5感染的流行病学调查和实验室检测提供了一种更加快速、敏感和可靠的手段。

目录

声明

摘要

附表与图清单

中英文专业词汇对照

1 引言

2 材料

2．1 材料及来源

2．2 引物

2．3 主要试剂

2．4 实验中主要试剂的配制

2．5 主要仪器设备

3 方法

3．1 病毒性脑炎病例的定义

3．2 采样地点的选择

3．3 样本的采集、运送和保存

3．4 样本的处理

3．5 病毒RNA的提取

3．6 反转录为cDNA

3．7 巢式PCR检测方法的建立

3．8 巢式RT-PCR检测方法的评价

3．9 病毒分离

3．10 攻击病毒TCID50滴定和稀释梯度的制备

3．11 应用-临床样本的检测

3．12 质量控制

4 结果

4．1 两对引物的选择

4．2 巢式PCR反应的优化

4．3 PCR扩增反应最终优化结果

4．4 扩增产物的检测及测序鉴定

4．5 方法学评价

4．6 TCID50检测结果

4．7 病毒分离结果

4．8 应用-临床样品的检测

5 讨论

5．1 病毒分离实验

5．2 巢式RT-PCR实验

5．3 应用

6 结论

参考文献

综述

个人简历、学习期间发表的相关论文与研究成果

致谢