自噬基因Atg3和Atg5在儿童急性白血病骨髓单个核细胞中的表达及临床意义

摘要

白血病是造血组织的恶性疾病，在儿童肿瘤中较为常见，其发病率呈逐年增高的趋势，随着治疗方案的进一步完善，大部分患儿尚能获得长期无病生存，但仍有较高的复发率或死亡率;目前的化疗只能有限的延缓白血病患儿的生命，很难从根本上扼制白血病细胞的复发与播散，因此有必要寻找更好的方法靶向治疗白血病，提高患儿总体的生存质量和生存率。
　　 自噬(autophagy)与肿瘤的关系是近几年来研究的热点，大量的研究发现，自噬对肿瘤有抑制及促进的双重作用，一方面，在肿瘤发生早期，自噬可通过增强自噬性细胞死亡，清除或修复受损的蛋白质或DNA，来抑制肿瘤的发生;另一方面，自噬在缺血缺氧的肿瘤细胞中，通过降解受损的细胞器及蛋白质为其存活提供能量，促进肿瘤细胞逃逸，利于肿瘤细胞的长期存活。在不同的肿瘤以及肿瘤发生的不同阶段，自噬的作用不同;因此，自噬与肿瘤关系密切，研究二者之间的联系为肿瘤的治疗提供了新的可行方向。目前，国内外对自噬与白血病关系的研究已逐渐深入，可通过药物诱导或抑制自噬来治疗白血病，有研究发现，在儿童ALL中自噬活性增高，通过抑制自噬来达到治疗白血病的目的，但自噬是如何诱发或抑制白血病细胞，其分子机制目前仍未明确。
　　 自噬发生过程严格受自噬相关基因(Atg)调控。随着研究的深入，已经发现大量新的自噬基因，如beclin1、ambra1、Atg3、Atg5等，检测这些基因在肿瘤中的作用，可能成为治疗肿瘤和解决耐药的新策略。自噬体的形成是自噬的关键，依赖于两个泛素样结合系统，Atg12-Atg5共轭系统和Atg3、Atg4、Atg7、Atg8脂化系统。其中Atg3、Atg5在自噬体的形成中起关键作用。Atg5在自噬过程中起调控作用，与保守蛋白Atg12结合，形成Atg12-Atg5蛋白结合系统，利于自噬体膜的延伸。Atg3在整个自噬过程起E2酶催化作用，促进Atg8与磷脂酰肌醇结合，参与自噬体形成的各阶段。通过检测Atg3及Atg5在儿童AL细胞中的表达，来推断自噬在儿童AL白血病中的作用，为其治疗提供新的方向及策略。
　　 目的：
　　 检测初治组、缓解组、复发组急性白血病(AL)患儿及对照组患儿骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcell，BMMNC)的自噬率，同时检测自噬相关基因Atg3、Atg5的表达情况，探讨自噬与儿童AL发生发展、复发的关系，揭示自噬相关基因在儿童急性白血病细胞肿瘤逃逸机制中的作用，为儿童AL提供新的治疗靶点和治疗策略。
　　 方法：
　　 收取2011年3月至2012年5月期间在郑州大学第一附属医院儿科血液病区确诊AL的患儿骨髓标本74例，初治组患儿37例（男21例，女16例），中位年龄6岁（2～12岁），经化疗完全缓解组28例（男16例，女12例），中位年龄5岁（2～10岁）;难治复发组9例（男7例，女2例），中位年龄6岁（2～10岁）。对照组选取非肿瘤性疾病（如:免疫性血小板减少症、过敏性紫癜）患儿骨髓标本28例（男17例，女11例），中位年龄6岁（3～13岁）。各组患儿的年龄、性别、细胞免疫分型差异无统计学意义(P＞0.05)，资料具有可比性。用淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞，经单丹磺酰尸胺(MDC)染色后制备玻片，于OlympusEX-71荧光显微镜下观察细胞自噬现象;采用流式细胞仪检测细胞自噬率;采用RT-PCR技术检测自噬基因Atg3mRNA和Atg5mRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.荧光显微镜下观察到初治组、难治复发组的细胞自噬现象较多见，而对照组、缓解组自噬现象较少见。流式细胞术检测结果发现，初治组、难治复发组的自噬率分别为(17.07±2.31)％、(15.37±1.59)％，明显高于对照组的(2.71±1.57)％，差异有统计学意义(P＜0.05)，缓解自噬率为(3.48±1.94)％，与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);难治复发组的自噬率显著高于缓解组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.Atg3mRNA和Atg5mRNA在初治组和难治复发组的表达均高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.008);缓解组和对照组相比差异无显著性(P＞0.008);二者在难治复发组的表达值明显高于缓解组，差异具有统计学意义(P＜0.008)。
　　 结论：
　　 1.初治组和难治复发组BMMNC的自噬活性增强，自噬相关基因Atg3mRNA、Atg5mRNA的表达均上调，揭示Atg3、Atg5基因激活诱导的自噬活性增强可能与儿童白血病的发生、发展和耐药机制有关。
　　 2.自噬活性增强可能促进白血病细胞逃逸，维持白血病细胞的长久存活。

目录

声明

摘要

英文缩写一览表

引言

材料和方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学分析

结果

1 MDC染色检测自噬现象结果

2 流式细胞仪检测自噬率

3 RT-PCR检测Atg3、Atg5 mRNA表达值

讨论

1 儿童AL的BMMNC自噬现象及意义

2 自噬相关基因Atg3、Atg5在儿童AL的表达及临床意义

结论

附图

参考文献

综述

个人简历及在校期间发表的学术论文

致谢