叉头状转录因子O1对高糖诱导下大鼠系膜细胞细胞外基质堆积的影响及其作用机制

摘要

背景：
　　糖尿病肾病（Diabetes nephropathy，DN）是由糖尿病常见微血管并发症。在DN发生发展过程中，肾小球系膜细胞(Mesangial cells，MCs)过度增殖功能紊乱，引起细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)蛋白分泌与降解相对失衡而过度堆积于肾小球系膜区及基底膜，导致肾小球形态和功能发生改变，最终促进肾小球硬化症的发生。叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor,FoxO1)是叉头状转录因子O亚家族中的一员，在对抗氧化应激、调控细胞周期、调控增殖凋亡、调节蛋白分泌等方面发挥重要作用，其转录活性受磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)传导通路负向调控。研究发现，在STZ诱导的DN大鼠模型肾皮质中，FoxO1的活性水平有所下降，伴随以ECM相关蛋白表达升高。因此推测DN状态下FoxO1活性水平的降低与ECM蛋白过度堆积可能存在一定联系，但是FoxO1调节系膜细胞功能的具体机制尚不清楚。
　　高糖状态下MCs合成并分泌ECM的过程，与转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)相关联。研究发现，FoxO1与TGF-β传导通路存在交互关系。在HepG2细胞中，过表达FoxO1能够对抗TGF-β1引起的PAI-1（Plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）水平的升高，后者能够抑制纤溶酶原向纤溶酶的转变，减少ECM降解。因此推测，系膜细胞中FoxO1与TGF-β传导通路的交互作用，可能对ECM堆积产生影响。本实验以组成性激活突变型(Constitutively active，CA)FoxO1过表达慢病毒载体上调MCs中FoxO1的表达及活性，观察FoxO1对ECM相关蛋白堆积及TGF-β/Smad传导通路的影响，并对其机制进行探讨。
　　目的：
　　观察慢病毒载体介导的组成性激活突变型FoxO1过表达对于高糖培养下系膜细胞中TGF-β/Smad传导通路的激活及ECM堆积的影响，并对其机制进行初步探讨。
　　方法：
　　将本课题组构建的含组成性激活突变型（Constitutively active，CA）FoxO1编码序列的慢病毒载体（LV-CA-FoxO1）及空慢病毒载体(LV-NC-GFP)，转染于正常糖浓度(5.6mmol/L)培养的MCs。将未转染的MCs分为正常糖浓度组(NG组)和单纯高糖(25mmol/L)组（HG组），将转染后的MCs培养于高糖(25mmol/L)环境下分为LV-CA-FoxO1组（LV-CA组）和空病毒载体组(LV-NC组)。各组处理72h后，实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测各组FoxO1、纤连蛋白(Fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原蛋白(TypeⅠCollagen，ColⅠ)、纤溶酶原激活物抑制物1（Plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）、TGF-β1、转化生长因子βⅠ型受体(TGF-βtypeⅠreceptor，TGF-βRⅠ)、转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βtypeⅡreceptor，TGF-βRⅡ)、Smad3蛋白、Smad7蛋白mRNA的表达水平;Western blotting法检测PAI-1、FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Smad7的蛋白水平;细胞免疫荧光化学法检测TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad3、p-Smad3的表达及分布;免疫共沉淀检测Smad3与CBP蛋白(CREB-Bindingprotein，CBP)结合的改变。
　　结果：
　　1.LV-CA-FoxO1能够有效提高FoxO1表达及活性:与NG组相比，HG组p-FoxO1水平升高(P＜0.05)，转录活性下降;LV-CA组FoxO1、p-FoxO1蛋白水平均有所增加(P＜0.05)，但p-FoxO1/FoxO1水平下降，FoxO1表达增加，活性增强。
　　2.FoxO1过表达减少ECM堆积:与NG组相比，HG组FN、ColⅠ、PAI-1的表达水平均有所升高(均P＜0.05)，ECM分泌增加降解减少;与HG组相比，LV-CA组FN、ColⅠ、PAI-1的mRNA及PAI-1蛋白水平均有所下降(均P＜0.05)，ECM堆积得到改善。
　　3.FoxO1过表达减少TGF-β传导通路激活:与NG组相比，HG组TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡmRNA及蛋白水平升高（均P＜0.05）;与HG组相比，LV-CA组TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡmRNA及蛋白水平下降（均P＜0.05），细胞免疫荧光化学提示TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ在细胞内分布减少。
　　4.FoxO1过表达不影响Smad3蛋白表达，影响其磷酸化水平:Smad3是一种受体调节型Smad蛋白（Receptor-regulated Smad，R-Smad），能够促进ECM蛋白及PAI-1分泌。与NG组相比，HG组Smad3蛋白及p-Smad3蛋白水平增加;与HG组相比，LV-CA组Smad3蛋白表达无变化(P＞0.05)，p-Smad3水平降低(P＜0.05)。
　　5.FoxO1过表达抑制R-Smad蛋白转录活性:IF结果显示，HG组的Smad3及p-Smad3积聚于细胞核内，而LV-CA组Smad3和p-Smad3核质分布均匀。CO-IP显示HG组Smad3与CBP结合增加(P＜0.05);而LV-CA组Smad3与CBP结合减弱(P＜0.05)。HG组Smad3转录活性增强，LV-CA组则减弱。
　　6.FoxO1过表达上调Smad7表达:Smad7蛋白是一种抑制性Smad蛋白(InhibitorySmad，I-Smad)，能够抑制TGF-β/Smad通路激活。相比于NG组，HG组Smad7蛋白及mRNA水平降低（均P＜0.05）;LV-CA组较HG组Smad7蛋白及mRNA水平增加(均P＜0.05)。
　　结论：
　　1.高糖能够降低系膜细胞中FoxO1转录活性，引起ECM蛋白分泌增加、降解减少。
　　2.过表达活性FoxO1能够抑制高糖诱导的ECM蛋白过度堆积，改善系膜细胞功能紊乱，其可能通过抑制TGF-β/Smad传导通路的信号转导而实现。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

综述 叉头状转录因子FoxOs和糖尿病肾病的关系

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢