Caspase-3在乙醇致睾丸损伤中的表达及意义

摘要

研究目的
　　探讨腹腔注射乙醇对小鼠在实验期间的生长发育、睾丸指数以及生精功能的影响，掌握小鼠石蜡切片制备和HE染色等技术，采用荧光原位末端标记法（荧光TUNEL法）检测睾丸生殖细胞凋亡，实时定量-PCR检测Caspase-3mRNA的表达，Western-Blot检测Caspase-3蛋白的表达，初步探讨乙醇致睾丸损伤的机制，为长期接触乙醇或饮酒而致睾丸损伤患者的治疗提供了新思路，亦为临床治疗男性不育症探索新的方向。
　　研究对象和方法
　　1.选取24只体重相近的雄性昆明小鼠，随机分为对照组和实验组，每组各12只，记录每只小鼠初始体重。每天给予实验组小鼠15％的乙醇3g/kg腹腔注射，对照组小鼠腹腔注射等剂量生理盐水，连续处理14天，成功建立乙醇致睾丸损伤模型，再记录每只小鼠体重。
　　2.采用断颈法将所有小鼠处死，迅速收集并称重睾丸标本，计算睾丸指数。其中左侧睾丸置入Bouin's固定液中保存，右侧睾丸置入液氮罐中超低温保存。
　　3.将利用Bouin's液固定完成的睾丸标本制备石蜡包埋并切片，采用HE染色法观察两组睾丸曲精细管及生殖细胞形态学改变，采用荧光原位末端标记法(TUNEL)检测睾丸生殖细胞凋亡，应用实时定量-PCR(RT-PCR)检测Caspase-3mRNA的表达，应用蛋白免疫印迹法(Western-Blot)检测Caspase-3蛋白的表达。
　　4.采用SPSS17.0软件统计处理实验数据，两组独立样本定量资料，同时符合正态性及方差齐性时采用两独立样本的t检验;符合正态分布但方差不齐时，选用校正的t检验（t'检验）;不服从正态分布时，选用秩和检验。选择检验水准α=0.05。
　　结果
　　本实验采用15％的乙醇3g/kg给予小鼠腹腔注射14天后，成功建立乙醇致小鼠睾丸损伤模型。实验期间对照组小鼠饮食及活动正常，实验组小鼠出现亢奋、抓咬等醉酒现象。从乙醇处理前后体重改变来看，实验组体重增加明显小于对照组(P=0.03)，同时检测各组小鼠睾丸脏器指数（睾丸相对于小鼠实验前的体重），以及光镜下HE染色曲精细管直径变化，也得到基本一致的结果。实验组睾丸重量和体重的比值低于对照组(P＜0.05);HE染色显示实验组曲精小管直径和生殖细胞及精子数量均有异常改变;采用TUNEL检测两组小鼠生殖细胞凋亡指数，对照组生殖细胞平均凋亡指数为(0.1219±0.0184)，显著低于实验组小鼠(0.5732±0.0223)(P＜0.05);实时定量PCR结果显示实验组Caspase-3mRNA表达(2-ΔΔCt=3.35±0.13)显著高于对照组(2-ΔΔCt=1)(P＜0.05);Western-Blot结果显示Caspase-3蛋白表达(IntDen=44.51±8.94)显著高于对照组(IntDen=140.66±6.25)(P＜0.05)。
　　结论
　　乙醇对哺乳动物生长发育、睾丸、生精功能等具有明显的抑制作用，Caspase-3基因在乙醇对哺乳动物睾丸损伤过程中扮演着重要角色，与生殖细胞的凋亡密切相关，而乙醇本身或乙醇在体内的一些相关代谢产物可能牵涉到其作用机制，但是尚不能确定，需要之后多项实验进一步探讨。我们通过本实验可以确定乙醇对哺乳动物的负性影响，这或许可以让人们认识到过度饮酒的危害，为长期接触乙醇或饮酒而致睾丸损伤患者的治疗提供了新思路，亦为临床治疗男性不育症探索新的方向。

目录

声明

摘要

英文缩写一览表

引言

材料和方法

1 材料

1．1 研究对象与分组

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 建立动物模型

2．2 实验方法和标本处理

2．3 HE染色

2．4 荧光TUNEL检测

2．5 生殖细胞总RNA提取

2．6 RNA纯度测定

2．7 反转录合成cDNA

2．8 生殖细胞总蛋白提取

2．9 Real-time PCR测定Caspase-3 mRNA的表达

2．10 western blot检测Caspase-3蛋白的表达

3 统计学分析

结果

1 小鼠基本情况的变化

1．1 实验前后小鼠体重变化

1．2 小鼠睾丸平均重量及脏器指数

2 小鼠睾丸HE染色结果

2．1 睾丸组织病理学变化

2．2 曲精小管平均直径(MID)生精上皮细胞计数(CMSE)睾丸活检评分(Johnsen’s评分)变化

3 荧光TUNEL法检测细胞凋亡

4 Caspase-3 mRNA的表达

5 Caspase-3蛋白的表达

讨论

结论

附图

参考文献

综述 男性生殖细胞凋亡：规律及生物学特性

个人简历及在校期间发表的学术论文

致谢