小鼠树突状细胞与骨髓瘤细胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效应研究

摘要

目前肿瘤治疗方法主要有手术、化疗、放疗和生物治疗。其中肿瘤生物治疗是目前研究的热点，具有良好的前景，树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是肿瘤生物治疗的重点研究对象。树突状细胞是目前己知功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell，APC)，其在肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题将DC与肿瘤细胞融合制成瘤苗，使该融合细胞即表达肿瘤抗原又具有提呈抗原的能力。
　　Exosomes为一种直径30-120nm大小的囊泡状物质，其中含有核酸和蛋白质。多种细胞已经被证实在体外都能向细胞外释放exosomes，包括:多种血细胞（B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞，血小板）、肠上皮细胞、施万细胞（schwann，又名雪旺细胞）、脂肪细胞、神经细胞、纤维母细胞和多种肿瘤细胞系[37-41]。目前在临床和实验研究中具有抗肿瘤作用的exosomes主要有两种，一是肿瘤细胞产生的exosomes(Tumor Derived Exosomes，TEX)，因其含有许多肿瘤细胞所共有的肿瘤抗原，具有潜在的加强肿瘤细胞免疫原性、促进抗肿瘤免疫的作用[42];二是DCs来源的exosomes(Dendritic Cells Derived Exosomes，DEX)。也有研究表明，某些肿瘤细胞和不成熟树突状细胞来源的exosomes不能有效增强机体免疫，甚至具有免疫耐受作用。因此，exosomes是否具有抗肿瘤免疫效应，不仅与其来源细胞的特点和功能状态有关，也需要对获得的exosomes进行体内外试验进行功能验证。
　　考虑到DC细胞的抗原提呈能力和肿瘤细胞易增殖的特点，有研究者采用杂交瘤技术将DC与骨髓瘤细胞融合制成瘤苗，即克服了DC细胞分离提取和培养困难的问题，也克服了肿瘤细胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱点，在体内外研究上都显示出了抗肿瘤效应。但该融合细胞分泌exosomes是否具有融合细胞膜标志的特点、是否具有抗肿瘤作用，报道尚少。本文将骨髓瘤细胞和DC融合，再提取融合细胞分泌的exosomes，进行抗肿瘤效应研究。
　　目的:
　　为获得理化性质稳定、耐高温、制备时可质控，较细胞性瘤苗更具优越性的肿瘤治疗疫苗，本文通过收集DC/肿瘤细胞融合细胞上清液，分离提取exosomes，并对其进行鉴定和抗肿瘤效应研究，以期为DC/肿瘤细胞融合疫苗的应用开辟新的途径。
　　方法:
　　1.DC的提取和培养:取6-8周BALB/c雄性小鼠，无菌分离股骨、胫骨和腓骨，髓腔冲洗获得骨髓细胞，静置24h，去除未贴壁细胞，将贴壁细胞培养于含10％胎牛血清DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液中，加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF)20ng/ml，白细胞介素-4（Interleukin4，IL-4）10ng/ml，诱导其向DC分化。
　　2.骨髓瘤sp2/0细胞培养:从液氮中取出细胞株，复苏后在含10％胎牛血清DMEM培养液中培养，融合前用8-氮鸟嘌呤（8-Azaguanine，8-AG）处理两周。
　　3.DC与sp2/0细胞融合及鉴定:使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)化学融合法与电融合法相结合的方法制备DC/sp2/0融合细胞。流式细胞仪分析融合效率，激光共聚焦鉴定融合细胞。
　　4.DC/sp2/0融合细胞的培养:融合后将细胞移入96孔板，使用含1％HAT（H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin甲氨喋呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM选择培养基培养14天，改用含1％HT（H-Hypoxanthine次黄嘌呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM选择培养基培养7天，再改用正常10％胎牛血清DMEM培养基培养。培养期间加入GM-CSF100ng/ml。
　　5.Exosomes的提取及鉴定:收集经筛选后的融合细胞上清，采用密度梯度离心法[15]，提取上清液中exosomes，运用紫外分光光度仪对exosomes进行定量，用投射电镜观察exosomes形态，运用SDS-PAGE和western blot对exosomes进行鉴定。
　　6.T淋巴细胞分离和培养:自6-8周BALB/c雄性小鼠脾脏中分离单个核细胞，尼龙毛吸附法获得T细胞，含IL-2(30μg/ml)的10％胎牛血清DMEM培养液进行培养。
　　7.T淋巴细胞增殖实验:在T淋巴细胞培养液中加入exosomes，并用MTT比色法检测T细胞增殖。
　　8.DCex、imDCex及融合细胞Exosomes对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响:将T淋巴细胞培养液中分别加入DCex、imDCex和exosomes，6天后取三组T淋巴细胞作为效应细胞，进行CTL杀伤试验。设单独T细胞、骨髓瘤细胞为对照。使用MTT比色法检测T细胞靶细胞杀伤能力。
　　9.实验结果用统计学软件SPSS13.0分析。
　　结果:
　　1.DC与sp2/0细胞融合及鉴定:小鼠骨髓贴壁细胞经GM-CSF、IL-4体外诱导培养7d，呈现典型形态特征的DCs;与骨髓瘤细胞融合效率经流式细胞仪检测为45％左右，激光共聚焦显微镜下见到了双阳性的融合细胞。
　　2.DC/sp2/0融合细胞分泌exosomes的提取和鉴定:融合细胞呈贴壁生长，类圆形，收集上清提取exosomes经western blot鉴定显示，融合细胞分泌的exosomes携带有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子。对照组sp2/0细胞分泌的exosomes不带有MHC-Ⅱ分子。
　　3.T淋巴细胞增殖实验:融合细胞分泌的exosomes和成熟DCs来源的exosomes有显著促进T细胞增殖的作用，且与exosomes的剂量呈正相关，与对照组相比P＜0.01。未成熟DC分泌的exosomes不具有促进T细胞增殖的能力，与对照组相比，无显著差异，P＞0.05。
　　4.CTL实验:融合细胞分泌的exosomes和成熟DC来源的exosomes能诱导出CTL杀伤活性，与对照组相比，有显著性差异，P＜0.01;效靶比例以50:1时对靶细胞杀伤能力最强。未成熟DC分泌的exosomes不具有活化CTL的能力，与对照组相比，无显著差异，P＞0.05。
　　结论:
　　DC/sp2/0融合细胞能够分泌exosomes，该融合细胞分泌的exosomes有显著促进T细胞增殖的作用，并能诱导出CTL杀伤活性。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 小鼠骨髓瘤sp2／0细胞培养的状态观察

2．2 小鼠骨髓来源DC的光学显微镜下形态

2．3 DC／sp2／0融合细胞光学显微镜下观察

2．4 FACS鉴定融合细胞融合效率

2．5 激光共聚焦显微镜观察融合细胞

2．6 透射电镜下对exosomes超微结构和形态的观察

2．7 SDS-PAGE和western blot对exosomes进行鉴定

2．8 融合细胞分泌的exosomes促进T淋巴细胞增殖的作用

2．9 融合细胞exosomes激活的CTL对sp2／0细胞的杀伤活性

3．讨论

3．1 DC细胞及其抗肿瘤机制

3．2 DC／肿瘤细胞融合疫苗的制备

3．3 exosomes的来源、功能和抗肿瘤活性

4．小结

参考文献

综述 exosomes的组成，生物学功能和其在诊断治疗方面的潜能

个人简历及硕士在读期间发表论文

致谢