吡格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα及MUC5AC表达的影响

摘要

背景及目的：
　　近年来随着环境的日益恶化，支气管哮喘的发病率以每10年增加50％的速度持续上升，每年因哮喘死亡的人数达到250000以上。哮喘的发病原因众多且相互联系，主要涉及个人因素及环境因素，例如:基因、性别、感染、环境污染、饮食及肥胖等。其发病机制并未完全阐明，现认为炎症、重构及黏液高分泌是支气管哮喘的重要病理表现。目前糖皮质激素是治疗哮喘最有效的药物，但糖皮质激素的副作用限制了其广泛使用。吡格列酮是过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ）激动剂，PPARγ作为调节糖代谢及脂类的转录因子与2型糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化及肿瘤等慢性疾病的发生密切相关，其还具有显著地免疫调节、广泛的抗炎及调节缺血反应的作用。研究表明PPARγ激动剂除可以显著的减少促炎细胞因子(IL-6及IL-1β等)的产生外，还可抑制哮喘模型小鼠肺嗜酸粒细胞及气道高反应性。提示吡格列酮对哮喘治疗有一定作用，但其作用机制有待进一步研究。
　　A型γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid receptor,GABAAR)属受体门控离子受体超家族，α亚单位在GABAAR形成和功能中起重要作用。大量实验显示GABA合成酶和GABAAR能够表达于气道上皮细胞，进而组成了一个GABA系统，且哮喘时表达增强伴有黏液过度分泌。MUC5AC由气道杯状细胞分泌，反应了气道黏液分泌的情况。
　　本实验通过观察哮喘小鼠肺组织中的GABAARα、MUC5AC的表达水平及吡格列酮干预后的改变，初步探讨吡格列酮、GABAARα、MUC5AC之间的关系并藉此希望为哮喘的早期干预治疗提供理论依据。
　　材料方法：
　　按随机数字表法，把30只（6～8周龄）清洁级雌性BALB/C小鼠分为3组:正常对照组、哮喘模型组和吡格列酮干预组，各组均10只。实验的第1天、第8天，哮喘组及吡格列酮干预组小鼠腹腔注射(OVA)/Al(OH)3(含Al(OH)35mg和OVA50ug)混合液0.2ml致敏，从实验第21天起以20g/LOVA超声雾化吸入30min/d激发，连续7d。吡格列酮干预组于雾化OVA前30min雾化吸入吡格列酮(5×10-5mol/L)。正常对照组小鼠的致敏液以及雾化激发均以0.9％的氯化钠代替OVA。末次激发后24h，体积分数5％的水合氯醛400mg/kg麻醉小鼠，打开胸腔，结扎右肺门根部，生理盐水0.3ml行左肺支气管肺泡灌洗，共3次，合并得支气管肺泡灌洗液(BALF)。灌洗液离心后行肺泡灌洗液细胞分类计数，取右肺组织浸入体积分数10％中性甲醛中固定，经脱水、包埋制成蜡块，切片后部分行HE染色，部分用于免疫组化检测MUC5AC、GABAARα蛋白的表达水平。切取左肺叶迅速放入液氮中，速冻后转移至-80℃冰箱中用于RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应法）检测MUC5AC、GABAARαmRNA的表达水平。所有实验数据使用SPSS20.0软件进行统计分析。
　　实验结果：
　　1、各组小鼠症状比较:哮喘组小鼠在激发过程中出现打喷嚏、搔鼻、安静少动、点头样喘息等典型的哮喘症状:吡格列酮干预组上述症状与哮喘组相比较，症状稍轻;正常对照组未见明显异常症状。
　　2、各组小鼠BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞数:正常对照组小鼠、哮喘组小鼠、吡格列酮干预组的BALF中细胞总数分别为:(6.50±0.04)×109/L、（12.48±0.09）×109/L、（6.69±0.04）×109/L;各组哮喘小鼠模型中BALF中嗜酸性粒细胞数为:（0.05±0.01）×109/L、（1.32±0.09）×109/L、（0.08±0.01）×109/L。
　　3、各组小鼠肺组织病理观察:肺组织HE染色显示对照组小鼠气道黏膜上皮正常，气道周围未见炎性细胞浸润，肺泡壁结构未见破坏;哮喘组模型小鼠结构破坏明显，气道黏膜不完整，可见上皮局部脱落，黏膜下可见充血水肿，黏膜层较正常对照组小鼠增厚，支气管壁及血管壁周围有较多炎症细胞浸润;吡格列酮干预组黏膜上皮相对完整，黏膜下充血水肿、气道壁增厚及炎症细胞浸润较哮喘组减轻。
　　4、各组小鼠肺组织中GABAARα、MUC5AC蛋白的表达:免疫组化法检测肺组织中MUC5AC阳性染色仅见于支气管上皮细胞，表现为胞浆内棕褐色颗粒，GABAARα蛋白大都表达于气道上皮，阳性表达产物定位于细胞膜。3组小鼠肺组织均有一定程度的GABAARα、MUC5AC表达。哮喘组肺组织中GABAARα、MUC5AC蛋白表达强于吡格列酮干预组（P均＜0.05），且二者都高于对照组（P均＜0.05）。
　　5、各组小鼠肺组织中GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA的表达:RT-RCR（逆转录-聚合酶链反应）结果显示哮喘组小鼠肺组织GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA表达量均强于吡格列酮干预组（P均＜0.05），且两者都高于对照组（P均＜0.05）。
　　结论：
　　1、哮喘模型小鼠肺组织中GABAARα、MUC5AC表达增加，提示GABAARα可能与哮喘密切相关且可能与黏液过度分泌有关。
　　2、吡格列酮干预组可以降低哮喘小鼠肺组织中GABAARα、MUC5AC表达，提示吡格列酮可能通过下调GABAARα的表达在哮喘气道黏液过度分泌中起治疗作用。

目录

声明

摘要

引言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 3组小鼠症状的比较

2 3组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数

3 3组小鼠肺组织病理学改变

4 3组小鼠肺组织中GABAARα、MUC5AC蛋白的表达

5 3组小鼠肺组织中GABAARαmRNA、MUC5ACmRNA的表达

6 GABAARα及MUC5AC的蛋白及mRNA的两两相关分析

讨论

4．1 哮喘小鼠模型的建立及评价

4．2 GABAARα、MUC5AC在哮喘小鼠肺组织表达水平的变化

4．3 吡格列酮对哮喘小鼠肺组织GABAARα、MUC5AC的表达水平的影响作用

结论

参考文献

附图

综述 支气管哮喘与过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂

个人简历及在学期间发表的学术论文

致谢