甘蓝型油菜种子萌发时期油体蛋白双向电泳分析

摘要

油体是植物储存油脂的一种亚细胞结构，其中心部分是由三酰甘油组成的半透明基质，外层包裹磷脂单分子层，其中镶嵌多种油体结合蛋白。油体结合蛋白在油体的发生和富集、稳定和降解、信号转导、蛋白和脂类转运等过程中起到非常重要的作用。前人对于植物油体及油体蛋白的研究局限于静态研究方面，对于油体降解的动态过程研究较少。因此，利用蛋白质组学技术对萌发时期油体进行差异蛋白质组学分析有助于进一步解析油体降解过程中油体蛋白的组分、修饰状态等变化规律，这对于深入了解油体降解的分子机理以及探究油体相关蛋白的结构与功能具有重要意义。
　　本研究以甘蓝型油菜种子鼎油杂4号为实验材料，对萌发时期油菜种子油体形态变化、生理指标等进行了研究，同时采用双向电泳的方法对萌发过程中油体蛋白的变化规律及表达情况进行分析探究，为本实验室后续开展的油菜种子萌发时期具有稳定差异表达规律的油体蛋白质质谱鉴定以及油体降解的分子机理研究奠定基础。主要研究结果如下:
　　(1)建立了油菜种子油体荧光显微观察方法，探索了种子萌发过程中油体形态变化规律;确定了油体蛋白双向电泳研究的取样时间。采用石蜡切片方法结合尼罗红染色对甘蓝型油菜种子萌发过程中油体形态进行观察，结果显示:油体的降解主要发生在24小时之后，其中24-36小时之间油体降解幅度较大。综合油菜种子萌发时期生理研究及油体形态变化规律，将油体蛋白双向电泳研究的取样时间确定为0h、24h、36h、48h四个时间点。
　　(2)优化了油体提取方法，获得较高纯度的油体;探索了环境因素对油体稳定性的影响，结果显示pH和离子浓度对油体的稳定性影响较大，温度对油体的稳定性影响较小。在原有提取油体的基础上增加9M尿素洗脱和正己烷萃取等步骤，获得了较高纯度的油体，镜检结果显示油体平均直径为2.19μm。综合温度、pH、离子浓度等环境因素研究了不同环境条件对油体稳定性的影响，结果显示:在pH4-6之间油体稳定性明显下降，油体直径明显增大，pH值为5时油体直径达到最大值5.5μm为对照的228％;随着离子浓度的增加油体稳定性下降，油体直径持续增加，当NaCL浓度增加至250mM时油体直径达到5.62μm为对照的257％;温度对油体稳定性几乎无影响，不同温度下油体平均直径为2.33μm。
　　(3)优化了甘蓝型油菜种子油体蛋白双向电泳体系(two-dimensionalgelelectrophoresis，2D-PAGE)。通过纯化油体并在实验室已有提取蛋白方法的基础上提取萌发时期油菜种子油体蛋白;选取60mMTris裂解液(7MUrea，2M硫脲，4％CHAPS，2％两性电解质pH3-10，2％DTT，60mMTris)裂解蛋白干粉;确定油体蛋白双向电泳凝胶的最佳染色方法为硝酸银染色法。
　　(4)利用优化的管状凝胶双向电泳体系，对萌发时期油菜种子油体蛋白进行双向电泳分析，获得分离效果较好的差异蛋白表达图谱。图谱分析表明:差异蛋白稳定表达，图谱重复性较好，萌发过程中油体蛋白图谱整体相关系数为0.706021;四张图谱整体匹配出117个蛋白点，其中在0-24h、24-36h、36-48h之间表达差异量在二倍以上的蛋白点分别有47个、49个和61个;在0-48h之间持续表达差异量在二倍以上的蛋白点有19个;进一步通过PDQUEST软件分析结合手动校正最终确定在0-24h、24-36h、36-48h之间连续上调的蛋白点有7个，连续下调的蛋白点有10个。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物种子萌发的生理学

1．2 植物种子蛋白质组学研究进展

1．2．1 种子发育相关蛋白研究

1．2．2 种子亚细胞相关蛋白研究

1．3 植物中的油体及其研究现状

1．3．1 油体的基本特征

1．3．2 油体的合成与降解

1．3．3 油体相关蛋白

1．4 本研究的目的和意义

2 甘蓝型油菜种子萌发时期油体形态学观察

2．1 实验材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 主要试剂与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 油菜种子萌发实验

2．2．2 种子萌发时期粗脂肪含量测定

2．2．3 不同含油量油菜种子油体形态学观察

2．2．4 油菜种子萌发过程中油体形态学观察

2．3 结果与分析

2．3．1 油菜种子萌发时期形态学观察

2．3．2 油菜种子萌发时期相关生理研究

2．3．3 不同含油量油菜子叶储藏细胞油体形态观察

2．3．4 油菜种子萌发过程中油体形态学观察

2．4 讨论

2．4．1 油菜种子萌发时期取材时间的确定

2．4．2 油体观察方法的探讨

2．4．3 石蜡切片方法的改进

2．4．4 油体降解方式的探讨

3 甘蓝型油菜种子油体的制备

3．1 实验材料

3．1．1 供试材料

3．1．2 主要试剂与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 油体的提取

3．2．2 离体油体观察

3．2．3 环境对油体稳定性的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 离体油体观察

3．3．2 pH、离子浓度、温度对油体稳定性的影响

3．4 讨论

3．4．1 油体提取方法的改进

3．4．2 环境对离体油体的影响

4 油菜种子萌发时期油体蛋白质双向电泳分析

4．1 实验材料

4．2 主要试剂与仪器

4．3 实验方法

4．3．1 油体蛋白的提取

4．3．2 蛋白干粉裂解

4．3．3 蛋白定量

4．3．4 SDS-PAGE

4．3．5 双向凝胶电泳

4．4 结果与分析

4．4．1 油体蛋白SDS电泳

4．4．2 油体蛋白双向电泳

4．4．3 PDQUEST软件分析

4．5 讨论

4．5．1 凝胶染色方法的改进

4．5．2 样品裂解方法的优化

5 全文总结与展望

参考文献

致谢

个人简历及硕士期间发表的学术论文与研究成果