人去乙酰化酶SIRT1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

Sirtuin家族在生命体中广泛存在，是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，迄今为止在哺乳动物中发现的sirtuin家族成员有SIRT1～SIRT7，其中对SIRT1的研究最为广泛。在SIRT1介导的去乙酰化反应中，NAD+以共同底物的角色参与反应，该反应过程主要是在SIRT1的催化作用下将作用底物中的乙酰基转移到NAD+的ADP核糖基上，最终产物包括去乙酰化后的SIRT1底物，以及烟酰胺(NAM)和O-乙酰基-ADP-核糖。SIRT1的作用底物不仅有组蛋白底物，还有一部分非组蛋白底物，通过对这些底物的去乙酰化作用，SIRT1参与调控了机体的众多生理过程，例如细胞的凋亡、分化以及衰老，基因的表达调控、能量代谢等。同时SIRT1与肿瘤的发生发展有着重要的联系，但是其主要的作用仍存在着争议，这主要是因为在癌症中SIRT1究竟扮演着促癌因子还是抑癌因子的角色尚不能成定论，且在不同的肿瘤组织中其表达水平不够统一。尽管如此，SIRT1作为一个潜在的药物靶点，已经得到了越来越多的科学家的关注。本实验室拟采用基因工程的方法制备具有高生物活性和特异性的SIRT1重组蛋白，并对体外筛选SIRT1激动剂与抑制剂奠定了物质基础。
　　根据文献调研对人SIRT1蛋白选取其193-747位氨基酸片段作为活性片段，因所得cDNA的不正确性，采用OverlapPCR的方法对其进行了定点突变，获得了序列完全正确的活性片段，并将该片段克隆于pGEM-TEasy克隆载体中。鉴定正确之后，将正确的活性片段的基因片段连接入表达载体pET28b中，构建了重组表达载体pET28b/SIRT1。将得到的重组表达载体pET28b/SIRT1转化至E.coliBL21(DE3)，加入IPTG后进行诱导表达。提取蛋白后，经镍柱亲和层析纯化后得到目的蛋白。
　　成功构建了原核重组表达质粒pET28b/SIRT1，并用该质粒转化E.coliBL21(DE3)。重组蛋白以可溶蛋白形式表达，确定诱导表达的条件为:重组表达宿主菌37℃振摇培养至OD600约为0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃培养过夜。纯化后可以得到电泳纯度大于90％的重组蛋白。最后采用荧光定量比色法对纯化后的重组蛋白进行了活性检测，选用共价偶联的短肽Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-AMC作为SIRT1的去乙酰化底物，最终结果显示未加底物组与加底物组的荧光值存在明显的差异，证明该重组人SIRT1蛋白在外具有稳定的去乙酰化作用。且该活性检测法可以作为SIRT1抑制剂与激活剂的筛选模型。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第1章 前言

1．1 基因工程重组蛋白在大肠杆菌中的表达

1．2 融合蛋白表达技术

1．3 组蛋白修饰

1．4 SIRT1的研究进展

1．4．1 组蛋白去乙酰化酶

1．4．2 Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶-Sirtuin家族

1．4．3 SIRT1

第2章 载体构建

2．1 实验材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 菌种及载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 常用试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 人SIRT1基因的克隆

2．2．2 pET28b／SIRT1重组表达质粒构建

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 SIRT1片段的PCR扩增

2．3．2 重组克隆载体pGEM-T／SIRT1的酶切鉴定

2．3．3 重组质粒pET28b／SIRT1的酶切鉴定及序列测定

2．4 本章小结

第3章 重组蛋白的表达与纯化

3．1 实验材料

3．1．1 主要仪器设备

3．1．2 主要试剂

3．1．3 常用试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 SIRT1／pET28b在E．coli BL21(DE3)中的表达

3．2．2 表达蛋白的提取

3．2．3 IMAC法纯化重组蛋白

3．2．4 融合蛋白的定量估算

3．2．5 目的蛋白表达纯化结果检测

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 诱导表达产物的鉴定

3．3．2 IMAC纯化重组蛋白

3．3．3 目的蛋白浓度及收率测定

3．3．4 纯化后目的蛋白检测

3．4 本章小结

第4章 重组蛋白的活性检测

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂及耗材

4．1．2 常用试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 重组蛋白SIRT1的酶底物设计

4．2．2 重组蛋白的活性检测

4．3 实验结果与讨论

4．4 本章小结

结论

参考文献

个人简历

致谢