盐酸美金刚改善血管性痴呆大鼠认知功能的作用及机制研究

摘要

第一部分盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠认知功能的改善研究
　　目的:
　　随着老龄化社会的到来，血管性痴呆（VD）已成为第二大病因的痴呆。由于本病具有致残率和患病率高、治疗费用高及病程长等特点，给社会和病人的家庭带来了巨大的负担，因此血管性痴呆的治疗越来越受到人们的关注。
　　盐酸美金刚为电压依赖性N-甲基-D-天冬氨酸（N-METHYL-D-aspar-tate,NMDA）受体阻断剂，研究证实其对血管性痴呆有疗效，其改善血管性痴呆确切机制尚不完全清楚。
　　材料与方法：
　　1.1实验动物及给药
　　60只健康Wister大鼠,10-12月龄，体重约450～550g，随机分为盐酸美金刚治疗组，模型组，假手术组，共3组。根据01sson方法，采用结扎双侧颈总动脉的方法制备慢性脑缺血动物模型，治疗组于造模2月后即开始灌服盐酸美金刚3mg/kg/d，模型组(MDG)和假手术组(SOG)以等量消毒花生油灌胃。各组均每天1次给药，连续灌药1月。
　　1.2.行为学测试
　　分别于用药后及造模前、后利用Morris水迷宫对各组大鼠进行行为学测试。记录观察大鼠爬上平台的路线图、所需时间（逃避潜伏期）。然后进行空间搜索实验，将平台撤除，记录大鼠在池中60s内游泳路线及穿越原平台所在位置次数。
　　结果：
　　2.1逃避潜伏期模型组与美金刚治疗组比较，美金刚治疗组逃避潜伏期缩短，大鼠记忆能力明显改善。假手术组（25.1250士3.043s），模型组（51.3750士3.7392s）,美金刚组（40.1240士3.6815s），P＜0.05.
　　2.2跨越平台次数撤离平台后，盐酸美金刚治疗组大鼠穿过原平台所在位置次数明显增加，但不及假手术组，（假手术组，8.7273士2.6111，模型组3.4545士1.4397，美金刚组5.6364士1.8040，P＜0.05）与模型组相比，具有统计学意义。
　　结论：
　　给予盐酸美金刚干预血管性痴呆大鼠可明显改善大鼠的认知功能。
　　第二部分盐酸美金刚改善血管性痴呆大鼠认知功能的机制研究
　　研究目的:
　　Aβ沉积和胆碱能神经元减少为AD的典型病理改变。在AD病人的内嗅区皮质、额叶和颞叶皮层及海马存在乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶(CHAT)活性减低。大量研究证实，慢性脑缺血引起白质损伤可导致认知功能障碍。小胶质细胞活化增生、少突胶质细胞和星形胶质细胞减少为慢性脑缺血后白质改变。反映脑白质少突胶质细胞髓鞘的损伤的程度为碱性髓鞘蛋白(MBP)。几乎占脑容量的50％以上是星形胶质细胞，其对修复脑组织、神经元的存活起着重要作用，同时，过度增生的星形胶质细胞，对神经纤维的功能又有不良影响。星形胶质细胞的标志性蛋白为纤维酸性胶质蛋白(GFAP)。为进一步研究盐酸美金刚对血管性痴呆的作用机制，我们检测大鼠CHAT、APP、GFAP、MBP表达，观察痴呆大鼠脑超微结构。
　　材料与方法：
　　1.1.实验动物及给药
　　60只健康Wister大鼠,10-12月龄，体重约450～550g，随机分为盐酸美金刚治疗组，模型组，假手术组，共3组。根据01sson方法，采用结扎双侧颈总动脉的方法制备慢性脑缺血动物模型，治疗组于造模2月后即开始灌服盐酸美金刚3mg/kg/d，模型组(MDG)和假手术组(SOG)以等量消毒花生油灌胃。各组均每天1次给药，连续灌药1月。
　　1.2.脑标本采集
　　1.2.1免疫组化及HE染色：每组取3只大鼠在给药1个月后给予腹腔注射
　　10%水合氯醛（0.3g/kg），成功麻醉后，4%多聚甲醛灌洗，四肢僵直，取脑。4%多聚甲醛将脑组织固定于4℃的冰箱中24h，依次进行水洗，脱水，浸蜡，包埋石蜡，切片，2h60℃烘烤，2-6h37℃烘烤，4℃冰箱最后保存备用，用于免疫组化及HE染色。
　　1.2.2制作电镜标本：术后3月，每组取3只大鼠，迅速断头后取一侧海马CAl区及皮层脑组织，大小约1x1×2 mm3，4％戊二醛溶液中固定，备电镜用。
　　1.3免疫组化检测
　　室温复温冰冻切片后，进行免疫组化染色，观察皮层、海马CHAT、APP、GFAP、MBP表达情况。
　　1.4 RT-PCR检测
　　大鼠断头取脑后,利用Trizol法行RNA提取，进行引物扩增，凝胶电泳。
　　结果：
　　2.1 HE染色
　　假手术组：海马和皮质细胞偶见变性、死亡神经元，大部分是形态正常细胞。
　　模型组：神经元大量水肿、凋亡，神经元明显减少。
　　美金刚组：神经元水肿、凋亡较模型组减轻。
　　2.2电镜结果
　　假手术组：神经元的细胞核、细胞器显示清晰。
　　模型组：神经元可见线粒体脊消失，细胞器结构紊乱。
　　美金刚组：神经元细胞器结构紊乱较模型组减轻，细胞器数量较模型组增多。
　　2.3.免疫组化结果
　　2.3.1 CHAT免疫组化结果
　　取海马、额叶皮层进行ChAT阳性细胞计数，海马：假手术组：74.3000士3.2676：模型组：44.2222士3.4197；美金刚组：61.4000士4.2564；额叶皮层：假手术组：72.5000士3.4399；模型组：39.3333士3.2787；美金刚组：48.900士2.8460；假手术组与模型组相比，模型组ChAT的表达减少明显，具有统计学差异(P<0.05)；美金刚组与模型组相比，美金刚组ChAT的表达明显升高，具有统计学差异
　　(P<0.05)。
　　2.3.2 APP免疫组化结果
　　取海马、额叶皮层进行APP阳性细胞计数，海马：假手术组：26.1010士3.9001：模型组：65.50000士3.0276；美金刚组：47.7003士3.7431；额叶皮层：假手术组：30.0200士2.7878；模型组：72.7300士4.5472；美金刚组：44.2301士3.7947；假手术组与模型组相比，模型组APP的表达增加明显，具有统计学差异(P<0.05)；美金刚组与模型组相比APP的表达有所下调，具有统计学差异(P<0.05)。
　　2.3.3GFAP免疫组化染色
　　取海马、额叶皮层进行GFAP阳性细胞计数，海马：假手术组：12.1001士2.3309：模型组：31.7002士3.4657；美金刚组：20.4000士1.7127；额叶皮层：假手术组：111.4001士3.9496；模型组：39.4100士1.5055；美金刚组：21.8002士1.4757；模型组与假手术组相比，GFAP的表达明显增高，具有统计学差异(P<0.05)；美金刚组与模型组相比GFAP的表达下降明显，具有统计学差异(P<0.05)。
　　2.3.4MBP免疫组化染色
　　取海马、额叶皮层进行MBP阳性细胞计数，海马：假手术组：41.7001士1.8885；模型组：21.1010士2.3309；美金刚组：32.4000士2.0655；额叶皮层：假手术组：59.6101士3.2041；模型组：24.5000士1.0801；美金刚组：38.4010士2.2211；假手术组与模型组相比，模型组MBP的表达下降明显，具有统计学差异(P<0.05)；美金刚组与模型组相比MBP的表达明显增高，具有统计学差异(P<0.05).
　　2.4 RT-PCR结果
　　2.4.1各组大鼠海马CHATmRNA表达
　　假手术组：2.05±0.26；模型组：1.18±0.15；美金刚组：1.62±0.07；
　　与模型组比较， RT-PCR显示美金刚组海马CHATmRN表达较模型组明显增加， APP表达较模型组减少，其结果与免疫组化染色一致。
　　2.4.2各组大鼠海马APPmRNA表达
　　假手术组：72.85±16.46；模型组：105.85±6.11；美金刚组：94.64±2.72；
　　与模型组比较，RT-PCR显示美金刚组海马APPmRN表达较模型组减少，其结果与免疫组化染色一致。
　　结论：
　　3.1慢性脑缺血3月后，大鼠病理变化为少突胶质细胞减少，星形胶质细胞反应性增生，神经元变性、坏死；
　　3.2盐酸美金刚可抑制皮层和海马的神经元变性、坏死；
　　3.3盐酸美金刚干预，可增加血管痴呆性大鼠脑内CHAT表达；可减少血管痴呆性大鼠脑内APP表达；可增加血管痴呆性大鼠脑内CHATmRNA表达；可减少血管痴呆性大鼠脑内APPmRNA表达。
　　3.4盐酸美金刚可使星形胶质细胞活化、增生减轻，抑制 GFAP表达；可上调MBP表达，抑制少突胶质细胞减少。

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第一部分 盐酸美金刚改善血管性痴呆大鼠认知功能的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 盐酸美金刚改善血管性痴呆大鼠认知功能的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述一: 胆碱能系统与血管性痴呆的关系

综述二: 血管性痴呆与脑白质损伤的关系

博士期间发表的文章

致谢