磁靶向热敏脂质体为载体的肿瘤诊断体系的研究

摘要

临床上肿瘤的单独化疗常常会导致治疗效果不佳，探索多机制治疗肿瘤是提高肿瘤治疗指数的有效手段之一。C60具有作为药物转运载体和射频（RF）热治疗（RTT）的潜力，本研究将C60衍生化，使其具有磁靶向能力，并使其作为小分子射频发热剂，包裹在热敏脂质体内部，通过射频照射发热控制药物释放。其主要内容包括：（1）构建诊疗一体化的多功能脂质体药物转运系统；（2）以人源乳腺癌细胞（MCF-7）为模型对其体外抗肿瘤活性进行评价；（3）采用鼠源黑色素瘤B16-F10细胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤模型，对其体内抗肿瘤活性评价。
　　为使C60具有磁靶向和肿瘤诊断功能，首先将四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4）通过水热法化学键合到 C60的表面，并用 PEG2000进行修饰，以改善 C60-Fe3O4的水溶性和生物相容性，合成的C60-Fe3O4-PEG2000具有超顺磁性和射频敏感性。然后将 C60-Fe3O4-PEG2000和多西他赛（DTX）抗肿瘤药包裹在具有叶酸靶头的热敏脂质体中，形成的载药系统（DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000）将主动靶向和磁靶向相结合，使肿瘤细胞对药物有更高的摄取量，提高了肿瘤治疗指数。
　　DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的制备采用薄膜法，在单因素考察的基础上，采用正交实验优化处方。将制备的 DPPC/ C60-Fe3O4-PEG2000进行了表征，其平均粒径为172.2±1.6nm；透射电镜（TEM）结果显示，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000为类球形；差示扫描量热（DSC）分析结果显示，热敏脂质体的相变温度42℃；采用超滤离心法和HPLC法测定载药系统中DTX的包封率，结果表明：DTX在脂质体中的包封率达90％；采用透析袋法分别测定了热敏脂质体在37℃和42℃时DTX的体外释放，结果表明通过调节温度能较好的控制药物释放DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000具有强磁性，MRI实验表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在磁共振共振T2场成像，具有明显的浓度依赖性和黑化效应。
　　本研究选择人源乳腺癌细胞（MCF-7）作为其体外抗肿瘤活性评价的模型，考察了DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的细胞射频照射毒性及其影响因素，并初步研究了其细胞毒作用机制，包括细胞内摄取实验、活性氧的测定、细胞周期和细胞凋亡等。采用 SRB法考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的细胞毒性，结果显示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在射频照射下显著增强细胞抑制率，明显增强细胞毒性；射频照射时间对细胞毒产生影响，照射20min时的抑制率最大。MCF-7摄取实验中，与C60-Fe3O4-PEG2000相比，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000有更多的细胞摄入量，表明连有叶酸靶头的热敏脂质体更有利于包裹药物进入细胞内部；利用荧光探针进行活性氧检测，结果显示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在13.56MHz射频照射下，能够产生大量的活性氧；采用流式细胞仪测定了细胞凋亡和细胞周期，结果显示，射频照射下 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能够引起更多的肿瘤细胞凋亡，改变原有的细胞周期，影响了细胞的有丝分裂，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用。
　　采用鼠源黑色素瘤B16-F10细胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤作为其体内抗肿瘤活性评价的模型。DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX的体内抗肿瘤效果评价中，考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX分别在射频和为射频条件下对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，结果表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在叶酸靶向和磁靶向的载体系统双重作用下药物更易于滞留在肿瘤部位，13.56MHz射频照射后产生热量，使药物和 C60-Fe3O4-PEG2000从热敏脂质体中释放出来，实现多机制杀伤肿瘤细胞的效果。DTX在小鼠血浆的药代动力学实验结果表明， DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX明显延长了DTX在血液中的循环时间。药物在各组织中的分布结果显示，具有磁靶向的 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX使药物更多的聚集在肿瘤部位，该结果也进一步证明构建的纳米给药射频热疗体系在体内的磁靶向作用。此外，MRI结果显示注射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX后，在外加磁场作用下，小鼠肿瘤部位观察到明显的黑化现象，提示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX可作为体内磁共振成像T2场的造影剂。
　　体外抗肿瘤活性实验表明：DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX可有效的靶向MCF-7细胞，并高效的穿透细胞膜，携带更多的DTX进入细胞内部，射频照射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能高效的产生 ROS，发挥更强的射频热疗作用，释放出药物和C60-Fe3O4-PEG2000，从而诱导MCF-7细胞凋亡，最终抑制MCF-7细胞的生长和增殖。体内的抗肿瘤活性实验表明：DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX具有较低的系统毒性，并延长DTX在体内的循环时间，当肿瘤部位外加磁场时，能将更多的DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX纳米粒子滞留在肿瘤部位，射频照射， C60发挥其热疗作用，从而控制药物释放，通过 C60射频照射产生活性氧、肿瘤热损伤和DTX抗肿瘤药物多机制诱导肿瘤细胞的凋亡，最终抑制肿瘤的生长。另外，注射 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX纳米粒子后，使肿瘤部位在磁共振成像中T2场信号强度大幅度下降，可以将其用作肿瘤磁共振成像诊断的对比剂。
　　实验研究表明，本文设计的磁靶向热敏脂质体联合C60射频热疗法和DTX化学疗法，显著增强了抗肿瘤效果，有望成为一种潜在的肿瘤诊疗系统。

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英文缩略词表

前言

第一章 C60-Fe3O4-PEG2000纳米系统的构建

1 试药与仪器

2 实验方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第二章 C60-Fe3O4-PEG2000负载多西他赛热敏脂质体的构建及其性质考察

1 试药与仪器

2 实验方法

3 实验结果与结果

4 本章小结

第三章 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX纳米给药系统的体外抗肿瘤活性和靶向性研究

1 仪器与试药

2 实验方法

3 结果与结论

4 本章小结

第四章 多功能脂质体的体内药效学及靶向性的研究

1 仪器与试药

2 实验方法

3 实验结果

4 本章小结

第五章 多功能脂质体在荷瘤鼠体内药代动力学研究

1 仪器与材料

2 实验方法

3 实验结果与结论

4 本章小结

第六章 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在荷瘤小鼠体内组织分布及成像研究

1 仪器与试药

2 实验方法与结果

3 实验结果与结论

4 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

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